Апоптоз и его биологическое значение. Процесс апоптоза можно условно разделить на три фазы: сигнальную, эффекторную и деградационную. Рецептор-зависимый сигнальный путь
13195 0
Апоптозом (от греч. apoptosis — опадание) названо явление программируемой гибели клетки, сопровождаемой набором характерных цитологических признаков (маркёров апоптоза) и молекулярных процессов. Термин введён А. Керром с соавторами (Kerretal, 1972). Принципиальным отличием апоптоза от некроза является то, что первый сопровождается характерным каскадом реакций процесса элиминации клетки, а некроз есть результат незапланированного события и происходит спонтанно (Harmonetal., 1998) (рис. 1).
Рис. 1. Схема ультраструктурных изменений клетки при апоптозе и некрозе, предложенная лабораторией специальной микроскопии Донецкого ГМУ
Характерный каскад процессов при апоптозе включает: (а) конденсацию хроматина, (б) разрушение ядра, (в) вспучивание плазматической мембраны, (г) фрагментацию клетки с образованием дискретных апоптозных тел (АпТ). Апоптоз может быть вызван как внешними воздействиями (например, ядами), так и внутриклеточными сигналами, включая активацию «генов смерти». При этом механизмы апоптоза могут быть не только запрограммированными, но и спонтанными (Фильченков, Стойка, 1999).
Апоптоз в эволюции появился, по-видимому, вместе с появлением эукариотных многоклеточных организмов для регуляции численности клеток и установления между клетками в организме определенных взаимоотношений. Клетки взаимодействуют на разных стадиях жизненного цикла, например, при делении, росте, дифференцировке и гибели. Исследование молекулярных механизмов гибели (запрограммированной?) клетки стало в последние годы одной из самых трудных и актуальных проблем биологии.
Проблема апоптоза в настоящее время вызывает повышенный интерес со стороны специалистов разных научных дисциплин. Активацией апоптоза объясняют протекание СПИД, заболеваний локомоторного аппарата, нервной системы, болезней Вильсона, Паркинсона, Альцхаймера и Гетчинсона (прогерия , преждевременное старение). Вероятно, по механизму апоптоза отмирают клетки при ишемии мозга и инсульте, а также при анемиях (Белушкина, Белецкий, 2004).
В здоровом организме в норме в разных процессах также происходит удаление клеток путем апоптоза. Например, при росте и развитии организма. В процессе развития ЦНС нейронов образуется больше, чем необходимо, лишние удаляются. Апоптоз необходим также для реализации иммунного ответа. Один из механизмов защиты предполагает существенное увеличение количества лимфоцитов, которые при внедрении чужеродных микроорганизмов продуцируют антитела. После уничтожения этих микроорганизмов большинство таких специфических клеток соединительной ткани уничтожаются; таким образом, механизм удаления ненужных клеток необходим для выживания организма.
Этот механизм действует также при атрофии клеток под действием цитокинов (фактор некроза опухоли), при вирусных заболеваниях (например, при синдроме приобретенного иммунодефицита — СПИД), при нейрогенеративных заболеваниях. Недостаток апоптоза приводит к раку и другим опухолям; его избыток приводит к потере клеток. В молодом возрасте апоптоз является полезным, в дальнейшем он участвует в процессах старения.
Определены некоторые признаки апоптоза, отличающие его от некроза:
- фосфатидилсерин из внутреннего слоя цитоплазматической мембраны перемещается в наружный;
- цитохром с из межмембранного пространства митохондрий выходит в цитоплазму; активируются цистеиновые протеиназы (каспазы );
- увеличивается образование активных форм кислорода (АФК); цитоплазматическая мембрана сморщивается, а объем клетки уменьшается;
- нити ядерной ДНК в межнуклеосомных участках разрываются, хроматин конденсируется по периферии ядра, которое затем распадается на части;
- клетки фрагментируются на везикулы с внутриклеточным содержимым (апоптотические тельца ). В отличие от некроза, в случае апоптоза целостность цитоплазматической мембраны сохраняется до поздних стадий процесса, несмотря на сморщивание.
Выявлены некоторые молекулярные процессы, наблюдаемые при апоптозе:
1) действие Са 2 + и Zn 2 + (главных неорганических мессенджера и гормона , соответственно), имеющее взаимно антагонистический характер,
2) изменение мембранных белков в апоптотических клетках,
3) активирование разных путей передачи сигнала для апоптоза.
При апоптозе изменяются мембраны, в частности, гликопротеины и гликолипиды теряют сиаловую кислоту , а на клеточной поверхности увеличивается количество рецептора витронектина и, как указывалось выше, фосфатидилсерина — факторов, привлекающих макрофаги.
При апоптозе активируются разные изоформы фосфолипазы с, затем образуются вторичные мессенджеры диацилглицерин (DAG) и инозит-1,4,5-трифосфат (IP3). DAG активирует семейство сериновых и треониновых киназ (протеинкиназа с), a IP3 стимулирует освобождение Са 2 + из внутриклеточных депо в цитозоль. Вызывать апоптоз могут также тирозинкиназы и некоторые токсины , нарушающие гомеостаз Са .
Предложена гипотеза о существовании генетической программы самоуничтожения митохондрий, клетки, органа, организма, соответственно — митоптоз, апоптоз, органоптоз, феноптоз . Эта программа названа «самурайским законом биологии» (В.П. Скулачев, 1996). При апоптозе в клетке образуется специфический «белок самоубийства» р53 , который способствует реализации этой программы. Активация этого белка некоторыми интерферонами даёт эффект при лечении рака . В настоящее время проблему апоптоза исследуют весьма активно, так как она связана с решением проблемы старения. Если бы удалось регулировать апоптоз, можно было бы замедлить старение человека.
Исходя из гипотезы, что запуск программы самоуничтожения начинается вследствие снижения активности антиокислительной системы (АО С) в митохондриях и накопления в них активных форм кислорода (АФК), был предложен путь борьбы с этим явлением путем внедрения в органеллы клеток веществ с антиокислительными свойствами.
Однако действие известных естественных антиокислителей, в частности, витаминов С и Е, к успеху не приводило. Поэтому синтезировали вещества со свойствами АОС. После многочисленных испытаний оказалось, что оптимальным для этой цели являются фенилфосфониевые катионы (ФФК). Из них было синтезировано вещество, названное «ионом Скулачева» (SkQ). Он представляет собой комплексное соединение тетрафенилфосфониевого катиона , где ионом-комплексообразователем является Р(III) (рис. 2). Такая структура имеет делокализованный положительный заряд.
Рис. 2. Ион Скулачева — трифенилфосфин, связанный деканом с пластохиноном.
Видно, что SkQ алкилирован деканом C 10 H 22 образованием поляризованной молекулы с положительно заряженной головкой иона и липофильным хвостом. Этот комплекс легко проникает в клетку через отрицательно заряженную плазматическую мембрану в цитоплазму и через еще более отрицательно заряженную митохондриальную мембрану в матрикс органеллы и накапливается там, предположительно, в результате простого взаимного притяжения разноименных зарядов по физическим законам. Пластохинон, по мнению авторов, увеличивает антиоксидантную активность иона.
Точечное воздействие даже при наноконцентрациях позволяет этому комплексу длительно находиться внутри митохондрий (до 4-суток). Ферменты, находясь в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), не могут разрушить этот комплекс внутри митохондрий, поскольку неспособны преодолеть мембранный барьер.
Скулачев полагает, что антиокислительные свойства иона SkQ, позволяют нейтрализовать свободные радикалы внутри митохондрий и тем самым оказывают положительное фармакологическое действие, активируя АО С. Однако такое объяснение совсем не учитывает твердо установленное влияние на процессы апоптоза ионов металлов, в частности, Са 2 + и Zn 2 + , и законы межэлементных взаимодействий, в частности, их антагонизм.
С точки зрения бионеорганики механизм процессов апоптоза и влияния на них фенилфосфониевых катионов более сложен. В соответствие со следствием закона замещения , «свободный» Са вытесняет ионы переходных металлов из комплексов с белками и нуклеопротеинами, нарушая их функционирование и вызывая полимикроэлементоз . Избыток Са 2 + вытесняет Mg 2 + , инактивируя все обменные процессы, связанные с АТФ. В первую очередь это проявляется в снижении активности натриевого насоса и, следовательно, мембранного потенциала (Ψ) и зависящих от него процессов нейтрализации свободных радикалов. Из-за вытеснения из ферментов АОС ионов металлов-комплексообразователей (Fe, Си, Se, Zn ) активность этих ферментов по определению снижается.
Поскольку основные ферменты АОС (каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза, глутатионпероксидаза) содержат гемин с Fe, Си , а селенопротеины — Se и I , избыток Са 2 + в цитоплазме автоматически приводит к резкому снижению антиокислительной активности без участия каких-либо генов. При преодолении фракционного порога начинается цепная реакция , то есть в каждом атоме с неспаренным электроном появляется свободный радикал. Запускается цепь превращений уже существующих валентнонасыщенных исходных молекул в более реакционноспособные продукты. Причем процессы апоптоза начинаются с нарушения деятельности мембран, вероятно, каким-то образом связанного с синтезом коллагена.
«Свободный» Са 2 + играет на начальных стадиях развития апоптоза ключевую роль, поскольку является инициатором цепной реакции. Его концентрация при апоптозе в клетках всегда увеличивается. «Свободный» Са цитотоксичен, он нарушает многие процессы метаболизма. В частности, в результате активируются эндонуклеаза , расщепляющая ДНК во внутренних участках нуклеосом, и тканевая трансглутаминаза , ковалентно связывающая белки с мембраной изопептидными связями. Понятно, что при этом нарушается функционирование и нуклеопротеинов, и мембран.
Zn 2 + , в соответствии с законом замещения , будучи ионом непереходного металла 4 периода, образующим комплексы с биолигандами с наибольшими К уст, способен снижать концентрацию Са в клетках и, следовательно, отдалять начало апоптоза. Поэтому его считают ингибитором этого процесса, подавляющим, в частности, активность эндонуклеазы и трансглутаминазы. Отмеченное всеми исследователями апоптоза замедление процесса гибели клеток при поступлении в них Zn 2 + объясняется тем, что содержание «свободного» Са 2 + в цитоплазме клеток уменьшается, а активность АОС возрастает. Поэтому можно полагать, что любое воздействие, снижающее фракцию «свободного» Са 2 + в клетке и её органеллах, будет замедлять процессы старения и оказывать положительный фармакологический эффект при заболеваниях, сопровождаемых накоплением этой фракции. Среди таких заболеваний можно назвать болезни глаз, остеопороз, прогерию и болезнь Дауна .
Механизм цепной реакции , как и его особенности, хорошо известны на примере атомной бомбы. Характерным свойством этой реакции является её многостадийностъ . Среди важнейших стадий — зарождение цепи (инициирование ), продолжение цепи (зарождение новых активных частиц = радикалов), обрыв цепи («гибель » активных частиц). Сами цепи могут быть неразветвленными , когда на каждую израсходованную активную частицу приходится одна вновь образованная, или разветвленными , когда на одну израсходованную активную частицу приходится две и более вновь образованных.
Разветвленные цепные реакции могут происходить в стационарном режиме, когда скорость разветвления меньше скорости гибели активных частиц, и в нестационарном , когда гибель происходит медленнее, чем разветвление. В этом случае скорость реакции возрастает по экспоненте и лимитируется только расходованием исходных веществ. Причем переход от стационарного к нестационарному режиму происходит скачкообразно при очень небольшом изменении концентрации одного из исходных веществ — наблюдается цепной «взрыв».
Цепные реакции отличаются очень эффективным изменением их свойств, и даже направленности, при наличии ничтожных примесей веществ, способных выводить из системы активные частицы, то есть ингибиторов , или, напротив, облегчать их формирование — инициаторов . Именно по такому механизму, многостадийно и очень медленно на первых стадиях, развивается процесс апоптоза. Следовательно, при рассмотрении этой проблемы надо исходить из общих закономерностей, а не частных, связанных с «генами смерти» или «борьбой» со свободными радикалами. Именно по этой причине антиокислительные витамины Е и С не оказывают существенного воздействия на процессы апоптоза, так как воздействуют не на причину цепной реакции, а на её следствие.
Р (III) в SkQ, являясь комплексообразователем, не способен многократно изменять свою валентность — что совершенно необходимо для процесса переноса электронов, происходящего в АОС. В то же время известно, что P (V), образуемый при окислении Р (III), является компонентом кислородных кислот, в частности фосфорной кислоты, которая легко связывается с Са 2 + , образуя трифосфат Ca 3 (P 3 O 10) 2 . Анион с пятивалентным фосфором в этом соединении является секвестрирующим агентом , а образовавшаяся соль устойчива, что выводит Са 2 + из «свободной» фракции.
С точки зрения бионеорганики фенилфосфониевые катионы, в случае их попадания внутрь клеток и митохондрий, служат эффективным источником активного фосфора для нейтрализации избытка «свободного» Са 2 + . То есть они, как и Zn 2 + , оказываются ингибитором цепной реакции апоптоза, но с иным механизмом действия.
Описанным механизмом апоптоза объясняется, в частности, факт продления жизни атлантического лосося при заражении жабр личинками двустворчатого моллюска жемчужницы Margarititera margarititera . Эти личинки усиленно поглощают «свободный» Са 2 + для построения своей раковины, то есть в данном случае оказываются секвестрирующим агентом в цепной реакции начавшегося полимикроэлементоза, блокируя эту реакцию.
Альбатрос живет около 50 лет, и в течение его жизни признаков старения, в том числе репродуктивной функции, не появляется, после чего птица неожиданно умирает от спонтанного «взрывного» ускорения процессов апоптоза. Это объясняется тем, что согласно правилу фракционного порога , в некоторый момент возрастающая концентрация «свободного» Са 2+ преодолевает такой порог, наступает нестационарная стадия цепной реакции, приводящая к быстрому финалу — смерти организма.
Опыты на животных (лабораторных грызунах, кроликах, собаках, кошках, лошадях) с дистрофией сетчатки и катарактой, которым закапывали в глаза 20 нМ раствор SkQ, показали, что после нескольких недель лечения болезни глаз излечивались, причем прозревали даже некоторые слепые животные. Получены положительные предварительные данные об использовании SkQ для лечения 12 различных старческих заболеваний, в частности, остеопороза, инфарктов и болезней глаз — глаукомы и катаракты . Предполагаемый механизм развития апоптоза показан на рис. 3.
Рис. 3. Предполагаемый механизм развития апоптоза
Проблема рака противоположна проблеме апоптоза. В отличие от старения, когда нужно замедлить процесс апоптоза, при раке нужно сделать прямо противоположное - ускорить этот процесс в раковых клетках. Наиболее эффективны для этого могут быть меры, увеличивающие содержание «свободной» фракции Са в цитозоле клеток и в митохондриях выше фракционного порога, после которого начинается цепная реакция апоптоза в виде гибели раковых клеток. Исходя из особенностей механизмов цепной реакции, подобный эффект должен проявляться уже при наноконцентрациях действующих веществ.
Что касается теории об апоптозе, как генетически запрограммированной смерти, не менее вероятной представляется гипотеза о цепной реакции нарушения металл-лигандного гомеостаза. Цепные реакции отражают более фундаментальные природные процессы, чем сопутствующие им генетически закреплённые биологические проявления. Поэтому гипотезу о природе апоптоза, как проявлении цепной реакции микроэлементоза кальция, переходящего в полимикроэлементоз, нельзя отбросить без объяснения роли металлов в этом процессе с точки зрения общераспространённой теории.
Известно, что запись кода не всегда соответствует «центральной догме» биологии (ДНК > РНК > белок). Открытие отмеченных Нобелевскими премиями обратных ревертаз, в том числе теломераз (2009 г.), а также прионов (Prusiner, 1997), подтверждает правомерность такой точки зрения. Активация «спящих генов» вызывается тем или иным состоянием металл-лигандного гомеостаза. Например, соотношение металлов, связанных с нарушением обмена Си , «будит» или ген синтеза белков болезни Вильсона, которая в настоящее время излечима, или ген синтеза белков болезни Менкеса, которая пока неизлечима. При этом «разбуженный» ген полностью подавляет другой (Bertini, 2008).
Медицинская бионеорганика. Г.К. Барашков
В процессе появления многоклеточных живых организмов понадобились механизмы регуляции правильного роста и развития, одним из таких регуляторов является апоптоз.
Апоптоз – это форма запрограммированной гибели клетки, которая проявляется в уменьшении размера клетки, фрагментации и конденсации хроматина, уплотнении мембран (наружной и цитоплазматической) без вытекания содержимого клетки в окружающую ее среду.
Процесс является двухфазным:
1. Первая фаза получила название латентной и основана на проведении сигналов апоптоза. Другими словами - «фаза решения проблем». В зависимости от характера действия раздражителей ее можно разделить на 2 типа:
а) повреждение ДНК посредством воздействий токсинов, радиации и других факторов;
б) активация рецепторов "регион клеточной смерти" (РКС).
«Регион клеточной смерти» - это рецепторы на мембранах всех клеток, которые воспринимают стимулы для активации апоптоза. Если количество активированных рецепторов увеличивается, то возрастает и количество физиологически гибнущих клеток. К наиболее изученным РКС относят CD95 (Fas, Apo1), TNFR1 (p55, CD120a), а также CAR1, D3, DR4, DR5 и др. Этот процесс не сопровождается повреждением ДНК.
2. Вторая фаза получила название «эффекторная», потому что в ней происходит разрушение клеточных ультраструктур. Основными исполнителями эффекторной фазы являются эндонуклеазы, цистеиновые протеазы (каспазы), лизосомальные и сериновые протеазы .
Farber E. (1994) предложил классификацию запрограммированной клеточной гибели (ЗКГ):
Запрограммированная онтогенетическая гибель клеток - это гибель, которая происходит в ходе нормального развития и/или метаморфоза клеток.
Запрограммированная физиологическая гибель дифференцированных клеток зрелых организмов в ходе деструкции гиперплазированных тканей в результате экзогенных и эндогенных повреждений органов и тканей. Она проявляет себя тогда, когда необходимо восстановление клеточного состава.
Запрограммированная биохимическая клеточная гибель после действия патоагентов разного происхождения. Этот тип смерти не физиологический, так как он представляет собой ответную реакцию организма (активную или пассивную) на повреждающий агент.
В основе всех форм ЗКГ лежит генетически определенная программа клеточной гибели. Это подтверждается участием многих генов в основе этой программы на уровне клетки и наличием специфических генов, которые контролируют этот процесс.
Существует несколько регуляторов апоптоза, одним из них происходит при участии цитокинов. Цитокины – это белки посредством которых происходит связь со специфическими рецепторами на клетках-мишенях и происходит регуляция их дифференцировки и пролиферации. Процесс апоптоза запускается в момент приближения специфического рецептора к его лиганду – экстрацеллюлярному белку смерти (TNF-a, FasL, TRAIL, Apo-3L). Наиболее изучен FasL лиганд, который обычно прикрепляется на активированные Т-лимфоциты и NK-клетки при взаимодействии со специфическими рецепторами APO1/CD95/Fas клетки. В тестикулах и тканях глаза FasL обеспечивает защиту от аутоиммунного повреждения собственных клеток. Принцип действия сводится к тому, чтобы активировать специфическую протеазу – каспазу 8, которая в свою очередь запускает процесс ЗКГ . Альтернативным путем является митохондриальный путь активации апоптоза при участии белков семейства Bcl-2. Этот путь апоптоза начинается с повреждения ДНК или действия на клетку токсических агентов. Ключевым событием это пути является повышение проницаемости наружной мембраны митохондрий, которое характеризуется выходом апоптогенных белков (цитохром С, прокаспаза -2,-3, и -9, AIF (фактор индуцирующий апоптоз) из межмембранного пространства в цитоплазму клетки за счёт разрыва митохондриальной мембраны или открытия высокопроницаемых каналов на внешней мембране митохондрий.
Важнейшим “рецептором” повреждения ДНК является так называемый «страж генома» - белок p53. Обычно этот белок находится в неактивном состоянии и активируется вследствие гипоксии, активации онкогенов, повреждения ДНК или воздействия других цитотоксических агентов. Роль гена в процессе ЗКГ очень важна, так как причиной развития 50 % опухолей является мутация гена p53. Регуляция апоптоза белком p53 происходит несколькими способами: активация генов Bax или Bid; активация образования свободных форм кислорода, что приводит к перекисному окислению, которое приводит к высвобождению цитохрома С из митохондрий; индуция мРНК Fas, а также выход Fas на поверхность клетки из аппарата Гольджи; стимуляция образования APAF-1; стимуляция экспрессии каспазы 6; переход части молекул самого гена p53 в митохондрии с последующим выходом цитохрома C .
Существенным механизмом апоптоза является синтез и активация проапоптических соединений семейства Bcl-2. Впервые белок семейства Bcl-2 описанные как онкоген при В-клеточной лимфоме, который привел к образованию опухолевого клона за счет увеличения выживаемости опухолевых клеток. . В настоящее время семейство Bcl-2 включает в себя группу белков со сходными морфологическими составами и делится на две группы: индукторы апоптоза и ингибиторы апоптоза. Решение о гибели клетки принимается на основании относительного преобладания активных супрессоров или промоторов апоптоза. Механизм действия основывается на действии проапоптических белков семейства Bcl-2, которые образуют временные мегаканалы на месте физиологических (для Ca2+, O2, Na+/К+), через которые начинает поступать цитохром С и другие факторы апоптоза. Цитохром С необходим для образования апоптосомы, в которой активируется каспаза 9.
Существует еще другой, стрессовый, путь апоптоза, который активирует каспазу 9 через комплекс Apaf-1 (апоптический протеаза-активирующий фактор). Конформационные изменения Apaf-1, индуцированные цитохромом С из поврежденных митохондрий и АТФ, позволяют привлечь профактор каспазы 9 через их общий домен. Каспаза 9 апоптосомы, в свою очередь, вызывает активацию эффекторных К(3,7), которые инициируют интенсивный протеолиз и высвобождают связанную ДНКазу, разрушающую хроматин. Особо следует отметить роль белка Bid, который является связующим звеном между двумя путями апоптоза – митохондриальный и путем «рецепторов смерти» (воздействие К8) .
В настоящее время изучение процесса апоптической гибели клетки имеет огромный интерес в медицине. Нарушение процессов физиологической смерти играет немаловажную роль в развитии патологических состояний, в том числе онкологических и аутоиммунных заболеваниях .
В настоящее время известно множество заболеваний, связанных с усилением апоптоза: фолликулярная лимфома, рак половой системы у женщин и мужчин (яичники, предстательная железа), гломерулонефрит, вирусные инфекции (аденовирус, вирус герпеса, поксвирус). А так же заболевания связанные с ингибированием процессов апоптоза: СПИД, нейродегенеративные заболевания (Альцгеймера, Паркинсона), токсические заболевания печени, мозжечковые дегенерации и т.д
Изучение механизмов апоптоза дает нам представления о развитии некоторых заболеваниях, их течении. Уже сейчас мы можем использовать эти знания для предотвращения заболеваний на различных стадиях патогенеза (коррекция и регуляция).
Апоптоз является очень важным процессом в онтогенезе каждого живого организма. Этот процесс позволяет поддерживать внутренний гомеостаз, контролировать правильный рост и развитие организма, без механизма апоптоза в нашем организме был бы хаос, многочисленность генетических изменений, беспорядочное деление клеток.
Список литературы:
1. Владимирская Е.Б. Механизмы апоптической смерти клеток / Е.Б. Владимирская// Гематология и трансфузиология. – 2002. – Т.47, №2, - С. 35 - 40.
2. Робинсон М.В. Апоптоз клеток иммунной системы / М.В.Робинсон, М.А. Труфакин// Успехи современной биологии. – 1991. –Т.3 вып. 2. – С. 246 – 259.
3. Adams J.M. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis / J.M. Adams // Genes and Development/ - 2003. – N 17. – P. 2481 – 2495.
4. Itoh K. Central role of mitochondria and p53 in Fas-mediated apoptosis of rheumatoid synovial fibroblasts / K. Itoh, H. Hase, H. Kojima et al. // Reumatology. – 2004. – N 43. – P.277-285.
5.& Newton K. Caspases signal not only apoptosis but also antigen-induced activation in cells of the immune system / K. Newton, A. Strasser// Genes and Development. – 2003. – Vol.17, N7. – P.819 – 825.
Инициация апоптоза может происходить посредством внешних или внутриклеточных факторов. Например, в результате гипоксии, гипероксии, субнекротического поражения химическими или физическими агентами, перекрёстного связывания соответствующих рецепторов, нарушения сигналов клеточного цикла, удаления факторов роста и метаболизма и т. д. Несмотря на разнообразие инициирующих факторов, выделяются два основных пути трансдукции сигнала апоптоза: рецептор-зависимый сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки и митохондриальный путь.
Рецептор-зависимый сигнальный путь
Схема передачи сигналов апоптоза при посредстве рецепторов смерти CD95, TNFR1 и DR3
Процесс апоптоза часто начинается с взаимодействия специфических внеклеточных лигандов с рецепторами клеточной гибели, экспрессированными на поверхности клеточной мембраны. Рецепторы, воспринимающие сигнал апоптоза, относятся к суперсемейству TNF-рецепторов. Наиболее изученными рецепторами смерти, для которых описана и определена роль в апоптозе, являются CD95 и TNFR1. К дополнительным относятся CARI, DR3, DR4 и DR5.
Все рецепторы смерти представляют собой трансмембранные белки, характеризующиеся наличием общей последовательности из 80 аминокислот в цитоплазматическом домене. Данная последовательность называется доменом смерти и является необходимой для трансдукции сигнала апоптоза. Внеклеточные участки рецепторов смерти взаимодействуют с тримерами лигандов. Тримеры лигандов в результате взаимодействия тримеризуют рецепторы смерти. Активированный таким образом рецептор взаимодействует с соответствующим внутриклеточным адаптером. Для рецептора CD95 адаптером является FADD. Для рецепторов TNFR1 и DR3 адаптером является TRADD.
Адаптер, ассоциированный с рецептором смерти, вступает во взаимодействие с эффекторами пока ещё неактивными предшественниками протеаз из семейства инициирующих каспаз с прокаспазами. В результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-адаптер-эффектор» формируются агрегаты, в которых происходит активация каспаз. Данные агрегаты именуются апоптосомами, апоптозными шаперонами или сигнальными комплексами индуцирующими смерть. Примером апоптосомы может служить комплекс FasL-Fas-FADD-прокаспаза-8, в котором активируется каспаза-8.
Рецепторы смерти, адаптеры и эффекторы взаимодействуют между собой сходными по структуре доменами: DD, DED, CARD. DD участвует во взаимодействии рецептора Fas с адаптером FADD и во взаимодействии рецепторов TNFR1 или DR3 с адаптером TRADD. Посредством домена DED осуществляется взаимодействие адаптера FADD с прокаспазами −8 и −10. Домен CARD участвует во взаимодействии адаптера RAIDD с прокаспазой-2.
Посредством рецепторов смерти могут быть активированы три инициирующие каспазы: −2; −8 и −10. Активированные инициирующие каспазы далее участвуют в активации эффекторных каспаз.
Митохондриальный сигнальный путь
Митохондриальный сигнальный путь апоптоза реализуется в результате выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки. Высвобождение апоптогенных белков, предположительно, может осуществляться двумя путями: за счёт разрыва митохондриальной мембраны или же путём открытия высокопроницаемых каналов на внешней мембране митохондрий.
Модель образования апоптосомы «Цитохром c Apaf-1 CARD прокаспаза-9». Активированная таким образом каспаза-9 рекрутирует прокаспазу-3, которая в свою очередь активируется до каспазы-3
Разрыв внешней мембраны митохондрий объясняется увеличением объема митохондриального матрикса. Данный процесс связывают с раскрытием пор митохондриальной мембраны, приводящим к снижению мембранного потенциала и высокоамплитудному набуханию митохондрий вследствие осмотического дисбаланса. Поры диаметром 2,6-2,9 нм способны пропускать низкомолекулярные вещества массой до 1,5 кДа. Раскрытие пор стимулируют следующие факторы: неорганический фосфат; каспазы; SH-реагенты; истощение клеток восстановленным глутатионом; образование активных форм кислорода; разобщение окислительного фосфорилирования протонофорными соединениями; увеличение содержания Ca в цитоплазме; воздействие церамида; истощение митохондриального пула АТФ и др.
В качестве альтернативного пути выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий рассматривается вариант образования белкового канала во внешней митохондриальной мембране. Так или иначе, в цитоплазму высвобождаются: цитохром c белок с молекулярной массой 15 кДа; прокаспазы −2, −3 и −9; AIF флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа.
Цитохром c в цитоплазме клетки участвует в формировании апоптосомы вместе с белком Apaf-1. Предварительно, Apaf-1 претерпевает конформационные изменения в результате реакции, протекающей с затратой энергии АТФ. Предполагается, что трансформированный Apaf-1 приобретает способность связывать цитохром c. К тому же открывается доступ CARD-домена Apaf-1 для прокаспазы-9. В итоге происходит олигомеризация не менее 8 субъединиц трансформированного белка Apaf-1 с участием цитохрома c и прокаспазы-9. Так образуется апоптосома, активирующая каспазу-9. Зрелая каспаза-9 связывает и активирует прокаспазу-3 с образованием эффекторной каспазы-3. Высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз.
Другие пути индукции апоптоза
Стоит отметить, что реализация апоптоза может происходить в результате комбинированного действия двух основных сигнальных путей рецептор-зависимого и митохондриального. Помимо этого, существует ряд менее распространённых механизмов инициации апоптоза. Например, за счёт активации прокаспазы-12, локализованной в эндоплазматическом ретикулуме. Высвобождение и активация прокаспазы-12 при этом обусловлены нарушениями внутриклеточного гомеостаза ионов кальция. Активация апоптоза также может быть связана с нарушением адгезии клеток.
В качестве ещё одного фактора индукции апоптоза рассматривается атака инфицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые, помимо активации Fas-рецептора, способны секретировать перфорин вблизи мембраны заражённой клетки. Перфорин, полимеризуясь, образует трансмембранные каналы, через которые внутрь клетки поступают лимфотоксин-альфа и смесь сериновых протеаз. Далее гранзим B активирует каспазу-3 и запускается каспазный каскад.
Возможна инициация клеточной смерти при высвобождении лизосомальных протеаз катепсинов. К примеру, каспаза-8 вызывает выход из лизосом активного катепсина B, который затем расщепляет регуляторный белок Bid. В результате образуется активный белок t-Bid, активирующий в свою очередь проапоптозный белок Bax.
Общая схема «классического» апоптоза млекопитающих
Эффекторная фаза
В течение эффекторной фазы различные инициирующие пути конвертируются в один общий путь апоптоза. Как правило, происходит активация каскада белков-эффекторов и регулирующих их белков-модуляторов. Основными эффекторами апоптоза являются каспазы. В процессе активации они запускают каспазный каскад: сложно переплетённые цепочки взаимодействий инициирующих и эффекторных каспаз.
Каспазный каскад
Каспазы представляют собой цистеиновые протеазы, которые расщепляют аминокислотные последовательности после остатка аспарагиновой кислоты. Каспазы образуются за счёт активации прокаспаз, в составе которых выделяют 3 домена: регуляторный N-концевой домен, большую и малую субъединицы. Активация происходит путём протеолитического процессинга: все три домена расщепляются, отделяется продомен, а оставшиеся большая и малая субъединицы ассоциируются, образуя гетеродимер. Два гетеродимера в дальнейшем формируют тетрамер полноценную каспазу с двумя каталитическими участками.
Каспазы обнаружены во большинстве живых организмов. У млекопитающих идентифицировано 13 каспаз. Часть из них в апоптозе не участвует. Остальные каспазы, которые участвуют в апоптозе, разделяют на инициаторные и эффекторные. Инициаторные каспазы активируют эффекторные каспазы, которые в свою очередь провоцируют и непосредственно участвуют в трансформации клетки. В итоге морфологические и биохимические изменения приводят к гибели клетки по типу апоптоза.
Одна из основных функций эффекторных каспаз заключается в прямом и опосредованном разрушении клеточных структур. Гидролизу подвергаются белки ядерной ламины, разрушается цитоскелет, расщепляются белки, регулирующие клеточную адгезию. Другой важной функцией эффекторных каспаз является инактивация белков, блокирующих апоптоз. В частности расщепляется ингибитор DFF, препятствующий активации апоптозной ДНКазы CAD. Разрушению подвергаются и антиапоптозные белки семейства Bcl-2. Наконец, в результате действия эффекторных каспаз происходит диссоциация регуляторных и эффекторных доменов, участвующих в репарации ДНК, мРНК-сплайсинга и ДНК-репликации.
Дополнительные эффекторы апоптоза
Помимо каспаз существуют и другие эффекторы апоптоза. Например, флавопротеин AIF, высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий, действует по независимому от каспаз пути. Попадая в клеточное ядро, AIF вызывает конденсацию хроматина и активирует эндонуклеазы, которые участвуют в фрагментации ДНК. На основании экспериментальных данных установлено, что апоптоз, протекающий в присутствии AIF, не предотвращается ингибитором каспаз. В качестве эффекторов апоптоза также рассматриваются кальпаины представители семейства цитозольных Ca-активируемых цистеиновых протеаз. Их роль в апоптозе пока слабо охарактеризована.
Деградационная фаза
Итогом программируемой клеточной гибели вне зависимости от изначального инициирующего воздействия является деградация клетки путём фрагментации на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Фрагменты погибшей клетки обычно очень быстро фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции.
Морфологические изменения
Условно деградацию погибающей клетки можно разделить на три последовательных фазы: высвобождения, блеббинга и конденсации. Деградация большинства клеток начинается с высвобождения прикреплений внеклеточного матрикса и реорганизации фокальной адгезии. Внутри погибающей клетки деполимеризуются микротрубочки цитоскелета. Внутриклеточные актиновые микрофиламенты реорганизуются в связанные с мембраной периферийные кольцевые пучки. В итоге клетка приобретает округлую форму. Следующая за высвобождением, стадия блеббинга, характеризуется сокращением периферийных актиновых колец. В результате сокращений клеточная мембрана образует вздутия, клетка как бы «кипит». Процесс блеббинга энергозависим и требует большого количества АТФ. Фаза блеббинга в нормальных условиях завершается примерно через час. В итоге клетка фрагментируется на маленькие апоптотические тела, либо целиком конденсируется, округляясь и уменьшаясь в размерах.
Биохимические изменения
На молекулярном уровне одним из последствий апоптоза является фрагментация ДНК с участием нуклеаз. Изначально образуются крупные фрагменты с 30 000-700 000 пар оснований, которые в дальнейшем расщепляются в межнуклеосомной области на отрезки по 180-190 пар оснований или кратные этим величинам. Фрагментация ДНК является характерным, но не обязательным признаком апоптоза, так как существуют наблюдения, в ходе которых процесс фрагментации ядра протекал без сопутствующей фрагментации ДНК.
Ещё одним существенным последствием апоптоза является экспрессия на внешней стороне плазматической мембраны специфических молекулярных маркеров, распознаваемых фагоцитирующими клетками: тромбоспондина; фосфатидилсерина и других фосфолипидов, содержащих фосфосерин.
Процесс, при котором клетка может убивать сама себя, называется запрограммированной клеточной гибелью (ЗГК). Этот механизм имеет несколько разновидностей и играет важнейшую роль в физиологии различных организмов, особенно многоклеточных. Самой часто встречающейся и хорошо изученной формой ЗГК является апоптоз.
Что такое апоптоз
Апоптоз - это контролируемый физиологический процесс самоуничтожения клетки, характеризующийся поэтапным разрушением и фрагментацией ее содержимого с формированием мембранных пузырьков (апоптозных телец), впоследствии поглощаемых фагоцитами. Этот генетически заложенный механизм активируется под воздействием определенных внутренних или внешних факторов.
При таком варианте гибели клеточное содержимое не выходит за пределы мембраны и не вызывает воспаление. Нарушения в регуляции апоптоза приводят к серьезным патологиям, таким как неконтролируемые клеточные деления или дегенерация тканей.
Апоптоз представляет собой лишь одну из нескольких форм запрограммированной гибели клетки (ЗГК), поэтому отождествлять эти понятия ошибочно. К известным видам клеточного самоуничтожения относят также митотическую катастрофу, аутофагию и программированный некроз. Другие механизмы ЗГК пока не изучены.
Причины апоптоза клеток
Причиной запуска механизма запрограммированной клеточной гибели могут быть как естественные физиологические процессы, так и патологические изменения, вызванные внутренними дефектами или воздействием внешних неблагоприятных факторов.
В норме апоптоз уравновешивает процесс деления клеток, регулируя их количество и способствуя обновлению тканей. В таком случае причиной ЗГК служат определенные сигналы, входящие в систему контроля гомеостаза. С помощью апоптоза уничтожаются одноразовые или выполнившие свою функцию клетки. Так, повышенное содержание лейкоцитов, нейтрофилов и других элементов клеточного иммунитета по окончании борьбы с инфекцией устраняется именно за счет апоптоза.
Запрограммированная гибель является частью физиологического цикла репродуктивных систем. Апоптоз задействован в процессе оогенеза, а также способствует гибели яйцеклетки при отсутствии оплодотворения.
Классическим примером участия апоптоза клеток в жизненном цикле вегетативных систем является осенний листопад. Сам термин происходит от греческого слова apoptosis, что буквально переводится как "опадание".
Апоптоз играет важнейшую роль в эмбриогенезе и онтогенезе, когда в организме сменяются ткани и атрофируются определенные органы. Примером могут служить исчезновение перепонок между пальцами конечностей некоторых млекопитающих или отмирание хвоста при метаморфозе лягушки.
Апоптоз может быть спровоцирован накоплением дефектных изменений в клетке, возникших в результате мутаций, старения или ошибок митоза. Причиной запуска ЗГК могут быть неблагоприятная среда (недостаток питательных компонентов, дефицит кислорода) и патологические внешние воздействия, опосредованные вирусами, бактериями, токсинами и т. д. При этом если повреждающий эффект слишком интенсивен, то клетка не успевает осуществить механизм апоптоза и погибает в результате развития патологического процесса - некроза.
Морфологические и структурно-биохимические изменения клетки во время апоптоза
Процесс апоптоза характеризуется определенным набором морфологических изменений, которые с помощью микроскопии можно наблюдать в препарате ткани in vitro.
К основным признакам, характерным для апоптоза клеток, относят:
- перестраивание цитоскелета;
- уплотнение клеточного содержимого;
- конденсацию хроматина;
- фрагментацию ядра;
- уменьшение объема клетки;
- сморщивание контура мембраны;
- образование пузырьков на клеточной поверхности,
- деструкцию органоидов.
У животных эти процессы завершаются образованием апоптоцитов, которые могут быть поглощены как макрофагами, так и соседними клетками ткани. У растений формирования апоптозных телец не происходит, а после деградации протопласта сохраняется остов в виде клеточной стенки.
Помимо морфологических изменений, апоптоз сопровождается рядом перестроек на молекулярном уровне. Происходит повышение липазной и нуклеазной активностей, которые влекут за собой фрагментацию хроматина и многих белков. Резко увеличивается содержание сАМФ, изменяется структура клеточной мембраны. В растительных клетках наблюдается образование гигантских вакуолей.
Чем апоптоз отличается от некроза
Главное различие между апоптозом и некрозом заключается в причине клеточной деградации. В первом случае источником разрушения служат молекулярные инструменты самой клетки, которые работают под строгим контролем и требуют затрат энергии АТФ. При некрозе происходит пассивное прекращение жизнедеятельности из-за внешнего повреждающего воздействия.
Апоптоз - это естественный физиологический процесс, сконструированный таким образом, чтобы не вредить окружающим клеткам. Некроз - это неконтролируемое патологическое явление, возникающее в результате критических повреждений. Поэтому неудивительно, что механизм, морфология и последствия апоптоза и некроза во многом противоположны. Однако имеются и общие черты.
В случае повреждения клетки запускают механизм запрограммированной гибели в том числе для того, чтобы не допустить некротического развития. Однако недавние исследования показали, что существует иная непатологическая форма некроза, которую также отнесли к ЗГК.
Биологическое значение апоптоза
Несмотря на то что апоптоз приводит к клеточной гибели, его роль для поддержания нормальной жизнедеятельности всего организма очень велика. Благодаря механизму ЗГК осуществляются следующие физиологические функции:
- поддержание баланса между пролиферацией и смертью клеток;
- обновление тканей и органов;
- устранение дефектных и "старых" клеток;
- защита от развития патогенного некроза;
- смена тканей и органов при эмбрио- и онтогенезе;
- удаление ненужных элементов, выполнивших свою функцию;
- устранение клеток, нежелательных или опасных для организма (мутантных, опухолевых, зараженных вирусом);
- предотвращение развития инфекции.
Таким образом, апоптоз является одним из способов поддержания клеточно-тканевого гомеостаза.
Этапы клеточной смерти
То, что происходит с клеткой при апоптозе, является результатом сложной цепочки молекулярных взаимодействий между различными ферментами. Реакции проходят по типу каскада, когда одни белки активируют другие, способствуя постепенному развитию сценария гибели. Этот процесс можно разделить на несколько этапов:
- Индукция.
- Активация проапоптических белков.
- Активация каспаз.
- Разрушение и перестройка клеточных органелл.
- Формирование апоптоцитов.
- Подготовка клеточных фрагментов к фагоцитозу.
Синтез всех компонентов, необходимых для запуска, реализации и контроля каждого этапа заложен генетически, почему апоптоз и называют запрограммированной гибелью клетки. Активация этого процесса находится под строгим контролем регуляторных систем, включающих в том числе и различные ингибиторы ЗГК.
Молекулярные механизмы апоптоза клетки
Развитие апоптоза обуславливается совокупным действием двух молекулярных систем: индукционной и эффекторной. Первый блок отвечает за контролируемый запуск ЗГК. В него входят так называемые рецепторы смерти, Cys-Asp-протеазы (каспазы), ряд митохондриальных компонентов и проапоптических белков. Все элементы индукционной фазы можно разделить на тригеры (участвуют в индукции) и модуляторы, обеспечивающие трансдукцию сигнала смерти.
Эффекторную систему составляют молекулярные инструменты, обеспечивающие деградацию и перестройку клеточных компонентов. Переход между первой и второй фазами осуществляется на этапе протеолитического каспазного каскада. Именно за счет компонентов эффекторного блока происходит гибель клетки при апоптозе.
Факторы апоптоза
Структурно-морфологические и биохимические изменения при апоптозе осуществляются определенным набором специализированных клеточных инструментов, среди которых наиболее важными являются каспасы, нуклеазы и мембранные модификаторы.
Каспазы - группа ферментов, разрезающих пептидные связи по остаткам аспарагина, фрагментируя белки на крупные пептиды. До начала апоптоза присутствуют в клетке в неактивном состоянии из-за ингибиторов. Главной мишенью каспаз являются ядерные белки.
Нуклеазы - ответственны за разрезание молекул ДНК. Особо важна в развитии апоптоза активная эндонуклеаза CAD, разрывающая участки хроматина в областях линкерных последовательностей. В результате образуются фрагменты длиной 120-180 нуклеотидных пар. Комплексное воздействие протеолитических каспаз и нуклеаз приводит к деформации и фрагментации ядра.
Модификаторы клеточной мембраны - нарушают асимметричность билипидного слоя, превращая его в мишень для фагоцитирующих клеток.
Ключевая роль в развитии апоптоза принадлежит каспазам, которые поэтапно активируют все последующие механизмы деградации и морфологической перестройки.
Роль каспаз в клеточной гибели
Семейство каспаз включает 14 белков. Часть из них не задействована в апоптозе, а остальные подразделяются на 2 группы: инициаторные (2, 8, 9, 10, 12) и эффекторные (3, 6 и 7), которые иначе называются каспазами второго эшелона. Все эти белки синтезируются в виде предшественников - прокаспаз, активируемых протеолитическим расщеплением, суть которого состоит в отсоединении N-концевого домена и разделении оставшейся молекулы на две части, в последствии ассоциирующиеся в димеры и тетрамеры.
Инициаторные каспазы необходимы для активации эффекторной группы, которая проявляет протеолитическую активность в отношении различных жизненно важных клеточных белков. К субстратам каспаз второго эшелона относятся:
- ферменты репарации ДНК;
- игибитор белка р-53;
- поли-(ADP-рибозо)-полимераза;
- ингибитор ДНК-азы DFF (разрушение этого белка приводит к активации эндонуклеазы CAD) и др.
Общее количество мишеней эффекторных каспаз насчитывает более 60 белков.
Ингибирование апоптоза клеток еще возможно на стадии активации инициаторных прокаспаз. Когда эффекторные каспазы вступают в действие, процесс становится необратимым.
Пути активации апоптоза
Передача сигнала для запуска апоптоза клетки может быть осуществлена двумя путями: рецепторным (или внешним) и митохондриальным. В первом случае процесс активируется через специфические рецепторы смерти, воспринимающие внешние сигналы, которыми служат белки семейства TNF или Fas-лиганды, расположенные на поверхности Т-киллеров.
В состав рецептора входит 2 функциональных домена: трансмембранный (предназначенный для связи с лигандом) и ориентированный внутрь клетки "домен смерти", индуцирующий апоптоз. Механизм рецепторного пути основывается на образовании DISC-комплекса, активирующего инициаторные каспазы 8 или 10.
Сборка начинается со взаимодействия домена смерти с внутриклеточными адапторными белками, которые, в свою очередь, связывают инициаторные прокаспазы. В составе комплекса последние превращаются в функционально-активные каспазы и запускают дальнейший апоптозный каскад.
Механизм внутреннего пути основан на активации протеолитического каскада особыми митохондриальными белками, выброс которых контролируется внутриклеточными сигналами. Выход компонентов органоидов осуществляется через образование огромных пор.
Особая роль в запуске принадлежит цитохрому с. Попадая в цитоплазму, этот компонент электротранспортной цепи связывается с белком Apaf1 (апоптотический фактор активации протеаз), что приводит к активации последнего. Затем Apaf1 связывают инициаторные прокаспазы 9, которые по механизму каскада запускают апоптоз.
Контроль внутреннего пути осуществляется особой группой белков семейства Bcl12, которые регулируют выход межмембранных компонентов митохондрий в цитоплазму. В составе семейства имеются как проапоптические, так и антиапоптические белки, баланс между которыми и определяет, будет ли запущен процесс.
К одним из мощных факторов, запускающих апоптоз по митохондриальному механизму, относятся реактивные формы кислорода. Еще одним значимым индуктором является белок р53, который активирует митохондриальный путь при наличии ДНК-повреждений.
Иногда запуск апоптоза клеток сочетает в себе сразу два пути: как внешний, так и внутренний. Последний обычно служит для усиления рецепторной активации.
Апоптоз
- запрограммированная гибель клетки в ответ на внешние или внутренние сигналы. Апоптоз происходит во время нормального развития, но может быть результатом рака, ВИЧ, болезни Альцгеймера.Распространенность в природе
Во время нормального развития организма апоптоз возникает в клетках при формировании формы или структуры органа. Например при образовании конечности мыши некоторые клетки подвергаются апоптозу и образуются пальцы.
Апоптоз во время нормального развития конечности мыши. Клетки подвергшиеся апоптозу (слева) мечены желтым. Та же конечность (справа) через один день.
Интересно, что некоторые птицы, такие как утка, имеют перепонки между пальцами, тогда как у других птиц, таких как курица, перепонок нет. В раннем эмбриогенезе и курицы и утки имеют перепонки между пальцами. Специфический белок BMP4 образуется в клетках между пальцами, запуская клеточную смерть этих клеток. Другой белок BMP (gremlin) образуется вокруг пальцев у обоих птиц и только у уток образуется также и в клетках перепонок, предотвращая запуск апоптоза в них.
Если добавлять белок gremlin в перепонку эмбрионов курицы, то она не подвергается апоптозу и сохраняется.
Слева лапка курицы после добавления в перепонку белка Gremlin (перепонка сохранилась), справа контрольный эксперимент без добавления белка (перепонка подверглась апоптозу).
Другим примером апоптоза в нормальном развитии является метаморфоз головастика лягушки. Под воздействием тиреоидного гормона при метаморфозе головастика лягушки, запускается апоптоз и хвост головастика исчезает.
Пути апоптоза в клетке
Существуют два основных пути апоптоза в клетке:митохондриальный путь и путь через рецепторы апоптоза (смерти).
1. Рецепторы апоптоза
- семейства белков CD95 (Apo-1 или Fas) и TNF-R (фактор опухолевого некроза). TNF-альфа высоко цитотоксичная молекула, использовалась как лекарство против рака. TNF-R1 рецептор широко распространен и поэтому не может быть избирательным. Другие представители этого семейства (не все) имеют домен клеточной смерти (DD) - домен белок-белкового взаимодействия связывающийся с белком адаптором, таким как FADD. Активация рецепторов апоптоза лигандами (например, CD-95L и TNF-альфа приводит к активации каспазы-8, запуская каскад реакций ведущих к апоптозу.
2. Митохондриальный путь
. Митохондрии выполняют центральную роль в апоптозе, при этом наблюдается увеличение проницаемости митохондриальной мембраны. Баланс между про- и анти-апоптозных членов семейства Bcl-2 регулирует выход про-апоптозных веществ из митохондрий, ведущих к запуску апоптоза, таких как AIF, эндонуклеаза G, Smac/DIABLO и цитохром C. Утечка цитохрома-С из митохондрии приводит к образованию апоптосомы в цитоплазме, которая активирует каспазу-9 и запускает клеточную смерть.
Оба пути приводят к активации каспаз и запуску каскада реакций приводящих к гибели клетки.
Каспазы
Каспазы
(caspase) - ферменты расщепляющие белки по остаткам аспартата. Они содержат цистеиновые остатки на своих активных центрах. Многие изоформы каспаз ведут к апоптозу. Они могут быть активированы двумя путями: через рецепторы апоптоза и митохондрии.
Первая открытая каспаза - Ced-3 (Cell Death-3), обнаруженная у нематоды C. elegans. Мутация Ced-3 предотвращала гибель 131 клетки в процессе нормального развития нематоды. Гомолог Ced-3 у млекопитающих - интерлейкин-1альфа-преобразующий фермент (ICE) и был позже назван ингибитор каспазы-1.
Каскад активации каспаз
Известно 14 каспаз, которые подразделяются на инициаторы, эффекторы и стимуляторы. Инициаторы (каспаза-8 и -9) расщепляют и активируют каспазы эффекторы (каспаза-3). Эффекторы расщепляют различные белки, что ведет к гибели клетки. Активация каспаз ведет к запуску протеолитического каскада реакций ведущих к гибели клетки. При этом одни каспазы активируют другие - амплификация сигнала.
Каспаза представляет собой тетрамер, состоящий из двух больших (~20kDa) и двух малых субъединиц (~10kDa). Большая и малая субъединицы образуется в результате расщепления прокаспазы. Каспаза содержат два активных центра QACXG. Ингибирующий домен (DED или CARD) может быть вырезан из каспазы.
Эффекторные каспазы активируются другими каспазами (трансактивация). Инициаторные каспазы активируются автоактивацией, которая происходит при взаимодействии нескольких прокаспаз (например, прокаспаза-8 и DISC). Рецептор апоптоза сам по себе не обладает протеазной активностью.
Активация каспаз ведет к различным последствиям:
каспаза-9 разрушает ядерные поры, что ведет к проникновению в ядро каспаз-3 и -7. Каспаза-3 расщепляет ингибирующую субъединицу ICAD в двух местах. Выпуск CAD приводит к расщеплению ДНК между нуклеосомами.
Каспазы ведут к реорганизации цитоскелета и распаду клетки на апаптозные тельца.
Каспазы
- семейство цистеиновых протеиназ, главные эффекторы апоптоза, существуют в клетке как неактивные проформы и зимогены, которые расщепляются на активные формы ферментов, активируя апоптоз.
Лиганд-->рецептор смерти-->активация инициаторов каспаз (каспаза-8, -10)-->каскад активации других каспаз>активация каспаз-3, -6-->инактивация клеточных структур.
Разрушение клеточных структур при апоптозе
Фрагментация хромосомной ДНК неактивный фермент CAD в комплексе с ICAD (ингибитор CAD-фактор фрагментации ДНК) расщепляется каспазой-3 высвобождая CAD, кот разрезает ДНК м-у нуклеосомами
Инактивация ферментов вовлеченных в репарацию ДНК - фермент поли (ADF-ribose) полимераза, или PARP- первый белок обнаруженный как субстрат для каспаз. PARP вовлекается в репарацию ДНК и катализирует синтез (ADF-ribose) и закрепляет на цепи ДНК ломая и изменяя ядерные белки. Способность PARP репарировать разрушения ДНК предотвращается последующим расщеплением PARP каспазой-3
Инактивация белков вовлеченных в репликацию. Каспазы могут инактивировать ДНК топоизомеразу II, способствуя разрушению ДНК.
Разрушение структурных ядерных белков. Каспаза-6 разрушает ламины разрушая ядро, что приводит к конденсации хромосом.
Чувствительность клеток к стимулам изменяется в зависимости от экспрессии про- и анти-апоптозных белков (Bcl-2 белок ингибитора), серьезности стумулов и стадии клеточного цикла
Распад клетки на везикулы, переход фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой, уменьшение объема клетки, сморщивание цитоплазматической мембраны, конденсация ядра (апоптозные тельца), фагоцитирующиеся макрофагами и клетками-соседями.
Инициаторы апоптоза
внешние сигналы (связывание лиганда индуцирующего смерть рецептором на клеточной пов-ти), быстрый вариант а
гранзим B может доставляться в клетки цитотоксичными T лимфоцитами, когда они узнают инфицированную клетку, активирует каспазы-3, 7, 8 и 10.
клеточный стресс
– радиация, химикалии, вирусная инфекции, недостаток фактора роста, ox стресс | кол-во bcl-2 белков определяет кол-во стресса необходимого для запуска а. Если митохондрии не справляются с удалением активных форм O2, последнии инициируют открытие пор во внеш. м-не и выход в цитозоль белка, ответственного за каскад реакций, ведущих к синтезу протеаз, нуклеаз
Митохондрия может быть ключевым регулятором каспазного каскада и апоптоза - избавление от цитохрома С в митохондрии может вести к активации каспазы 9 и затем каспазы 3. Этот эффект достигается через образование апоптосомы – мультипротеинового комплекса включающего цитохром C, Apaf-1, прокаспазу 9 и АТФ
Апоптосома
Цитохром C освобождается из митохондрий, связываясь с цитозольным белком Apaf-1. Это взаимодействие изменяет конформацию Apaf-1 которая стабилизируется связыванием ATP позволяя молекулам Apaf-1 ассоциировать друг с другом в колесоподобный комплекс состоящий из 7 молекул. Apaf-1, цитохром C и ATP - апоптосома, присоединяющая 7 молекул прокаспаз-9. Возможные механизмы:
1. Apaf-1, цитохром C и прокаспаза-9 – комплекс может активировать цитозольную прокаспазу-9 входящую в апоптосому.
2. Две апоптосомы взаимодействуют друг с другом активируя прокаспазу-9.
Оксид азота NO ингибирует апоптоз в лейкоцитах, гепатоцитах, трофобластах и эндотелиальных клетках. Эффект может быть вызван через нитрозилирование и инактивацию каспаз-3, -1, -8. NO взаимодействует с гемом гуанилат циклазы-->синтез сGMP-->активация cGMP-зависимой протеинкиназы-->экспрессия противоапоптозных белков.
bcl-2 - семейство белков
bcl-2 - семейство белков регуляторы апоптоза (bc-2, bcl-XL – противоапоптозные), (Bad, Bax – проапоптозные) | чувствительность клеток к апоптозным стимулам может зависеть от баланса противо- и проапоптозных bc-2 белков | стресс?проапоптозные bc-2 белки перемещаются на пов-ть митох, инактивируя антиапоптозные белки, что приводит к образ пор в митох и выпуск цитохрома с и др про-апоптозных молекул из межм-ного пр-ва-->формируется апоптосома-->активация каспазового каскада.
Проапоптозные члены Bcl-2 увеличивают проницаемость митохондриальной мембраны, что ведет к попаданию проапоптозных белков в цитоплазму. Противоапоптозные представители семейства - уменьшают проницаемость.
Bcl-2 разделяется на три субсемейства.
Bcl-2 субсемейство включает Bcl-2, Bcl-xL и Bcl-w, являющиеся противоапоптозными.
Bax субсемейство включает Bax, Bak и BAD, являющиеся проапоптозными белками. Их последовательности гомологичны регионам Bcl-2 субсемейства - BH1, BH2 и BH3, но не региону BH4.
BH3 субсемейство с единственным представителем - Bid, у которого гомологичен только BH3 регион.У Bid так же отсутствует трансмембранный домен.
Имеется несколько моделей, как Bcl-2 могут регулировать проницаемость митохондриальной мембраны.
Члены Bcl-2 семейства способны формировать гомо- и гетеродимеры. Гетеродимеризация между про- и противо-апоптозными представителями Bcl-2 ингибирует про-апоптозный белок.
Bcl-2 белки так же способны образовывать ионные каналы (Bcl-xL, Bcl-2 и Bax).
По другому механизму Bcl-2 образуют поры в митохондриальной мембране, осуществляющие неспецифический транспорт небольших молекул меньше 1.5kDa, что нарушает синтез ATP и ведеит к клеточной смерти. Так же цитохром-С и AIF могут выходить в цитоплазму и образовывать апоптосомуt. Bax и Bak - индуцируют выход цитохрома-С и AIF из митохондрий.
Сокращения.
DD - death domain
Caspases - (cysteinyl aspartate-specific proteases)
ICE - interleicin converting enzime