Mikroskopiskās metodes. Gaismas mikroskopija un tās iespējas Gaismas mikroskopā var redzēt
Konfokālais mikroskops un ar tā palīdzību izgatavotie attēli: putekšņlapu plaisāšana, ksilēmas trauki, hloroplasti stigmas šūnās.
Gaismas mikroskopija
Viena no galvenajām citoloģijas metodēm mūsdienās joprojām ir mikroskopija, kas paredzēta šūnas struktūras izpētei, to plaši izmanto fundamentālajā un lietišķie pētījumi. Mikroskopa izgudrojums ir saistīts ar Galileo Galilei (itāļu) un brāļu Jansenu (holandiešu) vārdiem 1609.-1611. Terminu "mikroskops" ieviesa Fabers (vācu valoda) 1625. gadā.
Šobrīd ir divi galvenie mikroskopijas veidi – gaismas un elektronu. Atšķirības starp tām slēpjas objekta izskatīšanas principā. Pirmajā gadījumā objekts tiek aplūkots elektromagnētiskā starojuma redzamās daļas plūsmā (viļņa garums = 400-750 nm), otrajā gadījumā - elektronu plūsmā. Šīm divām metodēm ir atšķirīga izšķirtspēja. Izšķirtspēja vai izšķirtspējas robeža ir minimālais attālums starp diviem punktiem, kuros tie ir redzami atsevišķi. Mikroskopa izšķirtspējas robežu nosaka starojuma plūsmas viļņa garums, kurā objekts tiek pētīts. Tāpēc ar dotā viļņa garuma starojumu var pētīt tikai tādas struktūras, kuru minimālie izmēri ir salīdzināmi ar paša starojuma viļņa garumu. Gaismas mikroskopijas izšķirtspējas robežu mikroskopu dizaineri sasniedza 19. gadsimta beigās un sasniedza 0,2 mikronus. Tas nozīmē, ka divi objekti, ja tos atdala mazāk par 0,2 mikroniem, parādīsies kā viens, pat ja mēs ievērojami palielināsim attēlu, piemēram, projicējot to uz ekrāna. Tāpēc ar gaismas mikroskopa palīdzību nav iespējams izmeklēt divus centriolus šūnu centrā, tie izskatās kā viens punkts (jāsaka, ka mūsdienu komerciāli ražotajos mikroskopos netiek realizēta maksimālā izšķirtspēja). Gaismas mikroskopa ierobežotās izšķirtspējas dēļ to var izmantot, lai pētītu ierobežotu skaitu intracelulāro struktūru, tostarp: kodolu, plastidus, lielas vakuolas un augu šūnu sienu. Mazākie gaismas mikroskopā skaidri redzamie objekti ir baktērijas un mitohondriji, kuru izmērs ir aptuveni 500 nm (0,5 mikroni), mazāki objekti nav skaidri redzami, palielinot lēcu apstrādes precizitāti, nevar pārvarēt šo ierobežojumu, ko nosaka gaismas viļņu raksturs.
Izšķirtspēja ir atkarīga ne tikai no gaismas avota viļņa garuma, bet arī no vides refrakcijas indeksa, caur kuru objekts tiek novērots, kā arī no leņķa, kādā gaismas stari iekļūst objektīvā. Standarta mikroskopa lēcu komplekts sastāv no: zema palielinājuma lēcām (x8) ar diafragmas atvērumu A = 0,2 un liela palielinājuma lēcām (x20) ar A = 0,40 un - (x40) ar A = 0,65. Šīs lēcas sauc par “sausām”, jo uz objektu skatās caur gaisu (refrakcijas koeficients n=1). Taču lielākā daļa mikroskopu ir aprīkoti arī ar īpašiem iegremdēšanas objektīviem, kuriem nepieciešama īpaša iegremdēšanas vide (n=1). Šāda vide var būt ūdens x40 VI objektīvam ir 0,75 diafragmas atvērums. Visizplatītākā ir eļļas imersija (n=1,51), pie x90 objektīva apertūras vērtība ir A=1,25. Ja tiek izmantota iegremdēšana, uzlabojas gaismas mikroskopa izšķirtspēja. Tomēr augstas izšķirtspējas objektīviem ir trūkumi: mazs lauka dziļums un zems kontrasts.
Visizplatītākā gaismas mikroskopijas metode ir gaišā lauka metode, kurā gaismas stari no apgaismotāja iziet caur objektu un nonāk objektīvā. Šādā veidā tiek pētītas fiksētās un iekrāsotās šūnas. Šūnu pamatstruktūru atklāšana ietver tādu krāsvielu komplekta izstrādi un izmantošanu, kas selektīvi krāso šūnu komponentus un nodrošina kontrastu to novērošanai. Ir daudz dažādu krāsvielu. Daži no tiem ir iegūti no augiem un dzīvniekiem, joprojām nav sintētisko analogu. Piemēram, plaši izmantotais hematoksilīns ir tropu baļķu koka ekstrakts, bet karmīns ir dažu laputu veidu tauku ķermeņa pigments. Tās visas ir tā sauktās kodolkrāsvielas, kas krāso struktūras, kas satur nukleīnskābes. Ar kodolu nesaistītas krāsvielas, sudraba nitrāta, izmantošana ļāva Kamillo Golgi 1898. gadā novērot un aprakstīt to, ko vēlāk sauca par Golgi aparātu.
Dzīvas šūnas iekrāsošana iespējama tikai retos gadījumos, tāpēc to pētīšanai tiek izmantotas citas metodes. Atšķirībā no spilgtā lauka metodes, novērojot objektus ar tumšā lauka metodi, apgaismotāja stari neietilpst objektīvā un attēlu veido tikai izkliedēti stari, kas nāk no objekta. Šajā gadījumā uz tumša fona var redzēt gaismas daļiņas, kuru izmērs ir mazāks par objektīva izšķirtspēju, lai gan daļiņu izmēru un formu ir grūti noteikt. Transmisijas gaismas tumšā lauka mikroskopija tiek izmantota, lai pētītu caurspīdīgus objektus, kas parasti ir neredzami gaišā laukā, un jo īpaši, lai apskatītu dzīvās šūnas. Dzīvās un mirstošās šūnas uz tumša fona izskatās pilnīgi atšķirīgi. Mirstošo šūnu protoplasts spīd spožāk, šim faktam nav izskaidrojuma. Šo metodi 1912. gadā izgudroja Zsigmondijs (Austrija). Gaismas mikroskopā var atšķirt objektus, kas maina apgaismojuma staru amplitūdu, bet dzīvās šūnas ir caurspīdīgas redzamajai gaismai un stari, izejot cauri šūnai, to praktiski nedara. mainīt amplitūdu. Cilvēka acs nespēj uztvert staru fāzes nobīdi, nemainot amplitūdu. Tāpēc fāzu kontrasta metodes (izgudroja Zernike (Nīderlande) 1934. gadā) un interferences mikroskopiju (izgudroja Ļebedevs 1932. gadā) izmanto īpaši dzīvo šūnu pētīšanai. Šādās sistēmās gaismas pāreju caur dzīvu šūnu pavada gaismas viļņa fāzes izmaiņas. Gaisma aizkavējas, izejot cauri biezām šūnas vietām, piemēram, kodolam. Notiek divu viļņu kopu rekombinācija, kas rada šūnu struktūru attēlu.
Lai pētītu objektus, kas ir divpusēji laužoši (cietes graudi, augu šķiedras, kristāli), tiek izmantota polarizācijas mikroskopija, kuras pamatus Ebners ielika 1882. gadā. Šajā metodē tiek izmantota speciāla polarizatora iekārta, kas pārvērš daudzvirzienu gaismas viļņus un tie iegūt vienu virzienu.
Fluorescences mikroskopijā objektu aplūko paša izstarotajā gaismā. Pirmo dienasgaismas mikroskopu izstrādāja Kellers un Zindentokfs 1908. gadā. Šīs metodes pamatā ir vairāku vielu spēja spīdēt, ja tās tiek apgaismotas ar īsa viļņa garuma stariem (violetiem vai ultravioletajiem). Fluorescences mikroskopiju bieži izmanto, lai identificētu specifiskas olbaltumvielas, antivielas, un Kūns bija pirmais, kurš izmantoja fluorohromus, lai saistīties ar antivielām, un šī reakcija tika nosaukta viņa vārdā. Citoembrioloģiskajos pētījumos šo metodi izmanto, lai pētītu struktūras, kas satur ogļhidrātu kalozi. Šai metodei tiek izmantota īpaša optiskā sistēma ar dzīvsudraba lampu, kas savienota ar gaismas mikroskopu.
Pēdējā laikā gaismas mikroskopijas iespējas ir ievērojami palielinājušās, jo tiek izmantotas jutīgas video sistēmas. Gaismas mikroskopa radītais attēls tiek apstrādāts videokamerā. Tas tiek attīrīts no “trokšņa”, pārveidots ciparu signālos un nosūtīts uz datoru, kur tas tiek papildus apstrādāts, lai iegūtu slēpto informāciju. Datora traucējumu mikroskopija ļauj sasniegt augstu kontrastu un analizēt caurspīdīgus objektus un dzīvās šūnas.
Elektronu mikroskopija
Ilgi un nepārtraukti centieni uzlabot pētniecības metodes Otrā pasaules kara beigās deva vēlamos rezultātus. Tieši tad, pateicoties apbrīnojamai apstākļu sakritībai, gandrīz vienlaikus zinātnieki tika bagātināti ar vairākiem jauniem spēcīgiem instrumentiem un pētniecības metodēm. Morfoloģijā šāds instruments bija elektronu mikroskops. Tas tika izveidots 20. gadsimta 30. gados, un tam bija pietiekama izšķirtspēja, lai iekļūtu šūnā līdz pat nanometru izmēra struktūrām. Tajā pašā laikā elektronu staram bija vāja iespiešanās spēja, un tas prasīja ļoti plānu materiāla paraugu sagatavošanu un lielu vakuumu. Tik stingras prasības radīja nopietnas grūtības, taču pārsteidzoši īsā laikā izdevās izstrādāt metodes audu paraugu sagatavošanai un uzbūvēt ierīces plānu griezumu iegūšanai no tiem. Objektu kvalitāte nepārtraukti uzlabojās, un līdz 1960. gadu sākumam tika aprakstītas daudzas iepriekš nezināmas šūnu struktūras.
Tātad elektronu mikroskopa izšķirtspēja ir daudz augstāka nekā gaismas mikroskopa izšķirtspēja. Teorētiski pie 100 000 V sprieguma tā izšķirtspēja ir 0,002 nm, taču elektronisko lēcu korekcijas dēļ tā samazinās un realitātē mūsdienu elektronu mikroskopos ir 0,1 nm. Būtiskas grūtības bioloģisko objektu novērošanā vēl vairāk samazina normālo izšķirtspēju, kas nepārsniedz 2 nm. Tomēr tas ir 100 reizes lielāks nekā gaismas mikroskopam, tāpēc elektronu mikroskopiju sauc par ultramikroskopisku.
Transmisijas elektronu mikroskopa vispārīgais dizains atgādina gaismas mikroskopa dizainu. Tas ir ievērojami lielāks par gaišo un šķiet apgriezts otrādi. Radiācijas avots elektronu mikroskopā ir katoda kvēldiegs, kas izstaro elektronus (elektronu lielgabals). Elektroni tiek izstaroti no aptuveni divus metrus augstas cilindriskas kolonnas augšdaļas. Lai nodrošinātu, ka elektronu kustībai nav šķēršļu, tas notiek vakuumā, anods paātrina elektronus un caur niecīgu caurumu ar šauru elektronu staru iekļūst kolonnas apakšējā daļā. Elektronu staru fokusē gredzena magnēti gar kolonnu, kas darbojas kā gaismas mikroskopa stikla lēcas. Paraugu novieto elektronu stara ceļā. Brīdī, kad tas iziet cauri paraugam, daļa elektronu tiek izkliedēta atbilstoši vielas blīvumam, pārējie elektroni ir fokusēti, veidojot attēlu uz fotoplates vai ekrāna.
Pirmo elektronu mikroskopu izveidoja Siemens 1939. gadā. Tas ļāva šūnā redzēt daudzas pārsteidzošas struktūras. Bet šim nolūkam bija jāizgudro pilnīgi jaunas zāļu pagatavošanas metodes, kuras sāka lietot kopš 1952. gada. Šūnas šajā gadījumā tiek fiksētas ar glutaraldehīdu, kas kovalenti saista olbaltumvielas, un pēc tam ar osmīnskābi, kas stabilizē proteīnu un lipīdu slāņus. . Paraugu dehidrē un piesūcina ar sveķiem, kas pēc polimerizācijas veido cietu bloku. Elektronu mikroskopijas sekcijām jābūt aptuveni 1:200 vienas šūnas biezumam. Šādu sekciju izgatavošanai tika izveidots ultramikrotoms (1953), kurā izmantoti stikla vai dimanta naži. Iegūtās sekcijas tiek novietotas uz īpaša vara sieta. Elektronu mikroskopa attēls ir atkarīgs no elektronu izkliedes, ko nosaka vielas atomu skaits. Bioloģiskie objekti sastāv galvenokārt no oglekļa, skābekļa un ūdeņraža, kuriem ir zems atomu skaits. Lai uzlabotu kontrastu, tie ir piesūcināti ar smagajiem metāliem, piemēram, osmiju, urānu un svinu. Plānās sekcijas ar transmisijas elektronu mikroskopiju neļauj spriest par šūnas trīsdimensiju struktūru, šo trūkumu var kompensēt ar sekciju sēriju, no kurām šūna tiek rekonstruēta. Tas ir ilgs process.
Ir arī tieša metode bioloģisko objektu trīsdimensiju struktūras izpētei - skenējošā elektronu mikroskopija - tā tika izveidota 1965. gadā. Šajā gadījumā objekta virsmas izkliedēti vai emitēti elektroni, kas ir jānostiprina, jāizžāvē un jāpārklāj. ar smagā metāla plēvi, tiek izmantoti attēla iegūšanai. Šī metode ir piemērojama tikai virsmu pētīšanai, un tās izšķirtspēja ir zema - aptuveni 10 nm.
Elektronu mikroskops
Transmisijas, zondes un skenējošie elektronu mikroskopi. Elektronmikroskopisks putekšņlapas un ziedputekšņu graudu virsmas attēls
Ķīmiskās metodes šūnu pētīšanai
Klasiskajam gaismas mikroskopam ir zema izšķirtspēja, kas neļauj izpētīt mazākas par 0,25 mikroniem šūnas struktūras detaļas. Otrais šūnas izpētes posms aizsākās laikā, kad mikroskopi strādāja, lai uzlabotu savus instrumentus. Tajā pašā laikā - 18. gadsimta beigas. – franču zinātnieks Antuāns de Lavuazjē un anglis Džozefs Prīstlijs rada jaunu zinātni – ķīmiju. Atšķirībā no morfoloģijas, kas virzās no sarežģītas uz vienkāršu, ķīmija virzās no vienkāršas uz sarežģītu. Ķīmija sākās ar elementu, atomu identificēšanu un pēc tam virzījās pa ceļu, pētot dažas no to vienkāršākajām kombinācijām - molekulām.
Bioloģiskās molekulas urīnvielas sintēze, ko 1828. gadā pirmo reizi veica vācu zinātnieks Frīdrihs Vēlers, palīdzēja šķērsot robežu starp neorganisko un organisko ķīmiju un ļāva iekļūt ķīmijas dzīvajā pasaulē. Tas iezīmēja sākumu ķīmiskās pieejas izmantošanai šūnu pētījumos. Nākamo simts gadu laikā aminoskābes, cukuri, tauki, purīni, pirimidīni un citas mazas molekulas tika atklātas, attīrītas, strukturāli pētītas un sintezētas. Zinātniekiem izdevās gūt priekšstatu par šo vielu metabolismu organismā un veidiem, kā no tām veidojas bioloģiskās pamatmolekulas: olbaltumvielas, polisaharīdi un nukleīnskābes. Bet atkal progresa ceļā radās nepārvarami šķēršļi: klasiskā ķīmija bija bezspēcīga, saskaroties ar šo lielo molekulu strukturālās sarežģītības sarežģītību. Ilgu laiku šūnas tika pētītas galvenokārt tās novērojot. Bet, tā kā eksperimentālā metode attīstījās dabaszinātnēs, to sāka izmantot dzīvo organismu izpētē. To veicināja spēcīgi biomedicīnas pētījumi, kas veikti 19. gadsimta otrajā pusē. 20. gadsimta sākumā. Amerikānis Ross Garisons un francūzis Aleksis Kerels atklāja, ka dzīvnieku šūnas var kultivēt in vitro, līdzīgi kā to dara ar vienšūnu organismiem. Tādējādi viņi demonstrēja šūnu spēju dzīvot neatkarīgi un izveidoja kultivēšanas metodi, kas šobrīd ir viena no aktuālākajām.
Bet visas šīs metodes, būtībā revolucionāras, joprojām bija netiešas, šūna palika slēgta melnā kaste. Milzīgā plaisa starp mazāko daļiņu, kas redzama gaismas mikroskopā, un lielāko molekulu, kas pieejama ķīmiskiem pētījumiem, palika nezināma. Šajā nezināmajā telpā tika paslēpti svarīgi jēdzieni un jēdzieni, aprakstīto šūnu struktūru funkcijas, to saistība ar zināmām biomolekulām palika nezināma - bez tā visa šūnas dzīve palika neatrisināta.
Savukārt bioķīmija ir bagātināta arī ar vairākām principiāli jaunām ierīcēm un metodēm. Īpašu interesi izraisīja hromatogrāfija, kuras pamatā ir ļoti vienkārša parādība – apmales jeb oreola veidošanās ap traipu (ko mēs redzam, mēģinot noņemt traipu ar īpašu šķīdumu). Šīs parādības pamatā ir dažādu krāsu kustības ātruma atšķirības izkliedējošā šķidruma plūsmā. 20. gadsimta sākumā krievu fiziologs un bioķīmiķis Mihails Semenovičs Cvets bija pirmais, kurš izmantoja šo fenomenu. Izlaižot ekstraktu no lapām caur vertikālu cauruli, kas pildīta ar adsorbenta pulveri, viņš varēja atdalīt galvenos lapu pigmentus - zaļo un oranžo - un iegūt tos atsevišķu krāsainu svītru vai gredzenu veidā gar caurulīti. Savu metodi viņš nosauca par hromatogrāfiju (grieķu khroma — krāsa, grafeīns — ierakstīt). Krāsa nomira salīdzinoši jauna, un viņa metodes potenciāls palika neizmantots līdz 40. gadu sākumam. Tagad ir daudz hromatogrāfijas variantu — piemērojams visām vielām, kuras var identificēt ķīmiski.
Tuva hromatogrāfijai ir gēla elektroforēze, kurā nevis šķīdinātāja plūsma, bet gan elektromotora spēks veicina elektriski lādētu komponentu kustību un atdalīšanu. Šīs metodes radīja revolūciju ķīmiskās analīzes jomā. Tagad analīzi var veikt gandrīz jebkura sastāva maisījuma nelielā daudzumā.
Otra metode, kas radikāli mainīja dzīvo šūnu ķīmisko izpēti, bija izotopu marķēšanas metode. Izotopi ir vienas un tās pašas lietas šķirnes ķīmiskais elements, kas atšķiras pēc atomu masas. Dabā pastāv daži izotopi, daudzus var iegūt mākslīgi kodolreakciju rezultātā. Izotopus izmanto, lai īpaši marķētu noteiktas molekulas, lai šādas molekulas varētu atšķirt no radniecīgām, netraucējot kopējo struktūru. Šo metodi izmanto biosintētisko procesu analīzē, ko nevarētu pētīt citādi. Piemēram, līdz ar marķēto aminoskābju ražošanu radās iespēja pētīt to kombināciju olbaltumvielās dzīvā organismā vai eksperimentālos apstākļos, pat neskatoties uz bezgalīgi mazo jaunizveidotā proteīna daudzumu tā radioaktivitātes dēļ. Šī metode kļuva plaši izplatīta, izveidojot kodolreaktorus un ražojot plašu radioizotopu klāstu. Bez marķētā atoma metodes attīstība šūnu un molekulārajā bioloģijā nebūtu bijusi iespējama.
Tādējādi gan morfoloģija, gan bioķīmija, bagātināta ar jaunām metodēm, tika pastāvīgi pilnveidota, plaisa starp viņu zināšanām kļuva arvien mazāka un pilnībā izzuda, kad radās iespēja sadalīt šūnu daļās tā, lai katru daļu varētu patstāvīgi pētīt.
Šādai frakcionēšanai izmantoto metožu pamatā galvenokārt ir centrifugēšana. Šī metode izmanto priekšrocības, ko sniedz atšķirības fizikālās īpašības, jo īpaši noteiktu izmēru un blīvumu sastāvdaļasšūnas, lai tās atdalītu vienu no otras. Tas ļāva izpētīt lielu daļu šūnas un apvienot morfoloģiskās un bioķīmiskās zināšanas.
Tomēr viena šūnas daļa — tās izšķirošā centrālā daļa, kodols — palika lielākoties nepieejama, līdz notika cits notikums. Tas sākās ar mēģinājumu, izmantojot ģenētiku, analizēt dažu vienkāršu vīrusu īpašības, kas inficē baktērijas un tiek sauktas par bakteriofāgiem vai baktēriju ēdājiem. Šis pētījums izrādījās pareizā pieeja ģenētiskās organizācijas problēmas risināšanai, kas pat visvienkāršākajos nešūnu organismos bija neparasti sarežģīta. Ilgu laiku Jaunā disciplīna, kas mūsdienās pazīstama kā molekulārā bioloģija, aprobežojās ar vīrusu un baktēriju izpēti, bet pēc tam burtiski ielauzās eikariotu šūnā, radot iespēju pētīt šūnu aktivitātes regulēšanu.
Lai izpētītu šūnu organizācijas molekulāro pamatu, ir nepieciešama detalizēta bioķīmiskā analīze. Tam nepieciešams ievērojams skaits noteikta veida šūnu, tāpēc nav iespējams izmantot audu gabalus, jo tie satur šūnas dažādi veidi. Pirmajā darba posmā auduma gabali tiek pārvērsti suspensijā. To var izdarīt, iznīcinot starpšūnu vielu un starpšūnu savienojumus. Lai to izdarītu, audus apstrādā ar proteolītiskiem enzīmiem, kas iznīcina olbaltumvielas (tripsīnu, kolagenāzi). Kalcijam ir svarīga loma šūnu savienošanā un to adhēzijā, tāpēc tiek izmantotas arī helātus veidojošas vielas, kas saista kalciju. Pēc tam audi tiek pakļauti maigai mehāniskai iznīcināšanai un sadalīti atsevišķās šūnās. Otrais posms ir suspensijas sadalīšana atsevišķās frakcijās. Lai to izdarītu, tiek izmantota centrifugēšana, ar kuras palīdzību lielās šūnas tiek atdalītas no mazajām, bet vieglās no smagajām, vai tiek izmantotas antivielas, un šūnu spēja piestiprināties pie stikla vai plastmasas ar dažādu stiprību. Trešais posms ir izolētu šūnu ievadīšana kultūrā. Pirmos eksperimentus 1907. gadā veica Harisons, kurš kultivēja abinieku muguras smadzenes plazmas receklī. Kultūras medijiem ir diezgan sarežģīts sastāvs. Standarta barotne tika izstrādāta 70. gadu sākumā, tā satur 13 aminoskābju komplektu, 8 vitamīnus un minerālsāļus. Turklāt barotnē var būt glikoze, penicilīns, streptomicīns, zirga vai teļa serums. Kā Hayflick un Moorhead parādīja 1961. gadā, lielākā daļa zīdītāju šūnu mirst kultūrā pēc noteikta skaita dalīšanās. Cilvēka ādas šūnas kultūrā dalās 50-100 reizes. Tomēr mutantu šūnas dažkārt parādās kultūrā un var vairoties bezgalīgi, veidojot šūnu līniju. 1952. gadā no dzemdes kakla vēža tika izolēta nepārtraukta šūnu līnija, kas pazīstama kā HeLa līnija. Šādas līnijas tiek uzglabātas -70 C temperatūrā pēc atkausēšanas, tās saglabā spēju sadalīties. Augu šūnu kultivēšanas metode tika izstrādāta līdz 1964. gadam. Izmantojot to, no sakņu šūnām in vitro bija iespējams izaudzēt veselu burkāna augu.
Gaismas un elektronu mikroskopijas metodes
1. Gaismas mikroskopija
gaismas elektronu mikroskopa traucējumi
Gaismas mikroskops var palielināt cilvēka acs izšķirtspēju aptuveni 1000 reizes. Šis ir mikroskopa "noderīgais" palielinājums. Izmantojot gaismas spektra redzamo daļu, gaismas mikroskopa maksimālā izšķirtspējas robeža ir 0,2-0,3 mikroni. Gaismas mikroskopijas metodes tiks apspriestas tālāk.
1 Tumšā lauka metode (ultramikroskopija)
Tumšā lauka metode caurlaidīgā gaismā ir balstīta uz Tyndall efektu, jo, līdzīgi kā putekļu daļiņas no gaismas stara, apgaismojot no sāniem, spīd sīkas daļiņas, no kurām atstarotā gaisma nonāk mikroskopa lēcā. Gaisma no apgaismotāja un spoguļa tiek novirzīta uz preparātu ar tumšā lauka kondensatoru. Izejot no kondensatora, galvenā gaismas staru daļa, kas, izejot cauri caurspīdīgajam preparātam, nemainīja virzienu, neietilpst lēcā. Attēls mikroskopā tiek veidots, izmantojot tikai nelielu daļu staru, ko izkliedē uz priekšmetstikliņa esošās zāļu mikrodaļiņas. Redzes laukā uz tumša fona ir redzami gaiši zāļu struktūras elementu attēli, kas atšķiras no vide refrakcijas indekss. Lielām daļiņām ir tikai spilgtas malas, kas izkliedē gaismas starus.
Ultramikroskopijas metode ir balstīta uz to pašu principu - preparāti ultramikroskopos tiek izgaismoti perpendikulāri novērošanas virzienam. Ar šo metodi var noteikt ārkārtīgi mazas daļiņas, kuru izmēri ievērojami pārsniedz jaudīgāko mikroskopu izšķirtspēju. Izmantojot iegremdējamos ultramikroskopus, ir iespējams reģistrēt līdz 2 lielu daļiņu klātbūtni preparātā. 10-9m Bet forma un precīzi izmērišīs daļiņas nevar noteikt, izmantojot šo metodi. Ultramikroskopus galvenokārt izmanto koloīdu ķīmijā. 2 Spilgta lauka metode un tās šķirnes Spilgtā lauka metodi caurlaidīgā gaismā izmanto, lai pētītu caurspīdīgus preparātus, kas satur gaismu absorbējošas daļiņas un detaļas. Ja zāles nav, gaismas stars no kondensatora, kas iziet cauri objektīvam, rada vienmērīgi apgaismotu lauku okulāra fokusa plaknes tuvumā. Ja preparātā ir absorbējošs elements, notiek uz to krītošās gaismas daļēja absorbcija un daļēja izkliede, kas izraisa attēla izskatu. Slīpā apgaismojuma metode ir iepriekšējās metodes variācija. Atšķirība starp tām ir tāda, ka gaisma tiek vērsta uz objektu lielā leņķī pret novērošanas virzienu, kas palīdz atklāt objekta “reljefu” ēnu veidošanās dēļ. Spilgtā lauka metodi atstarotajā gaismā izmanto, lai pētītu necaurspīdīgus objektus, kas atstaro gaismu. Apgaismojums tiek ražots no augšas caur objektīvu, kas vienlaikus pilda kondensatora lomu. Attēlā, ko lēca veido plaknē kopā ar caurules lēcu, ir redzama preparāta struktūra, pateicoties tā elementu atstarošanas spējai atšķirībai; Spilgtajā laukā izceļas arī neviendabības, kas izkliedē uz tiem krītošo gaismu. 1.3. Fāzes kontrasta mikroskopijas metode Lielākā daļa šūnu struktūru maz atšķiras pēc gaismas refrakcijas indeksa un staru absorbcijas viena no otras un vides. Lai pētītu šādas sastāvdaļas, ir jāmaina apgaismojums (ar attēla skaidrības zudumu) vai jāizmanto īpašas metodes un instrumenti. Fāzes kontrasta mikroskopijas metode ir viena no tām. To plaši izmanto šūnu dzīvībai svarīgos pētījumos. Metodes būtība ir tāda, ka pat ar ļoti nelielām dažādu preparāta elementu refrakcijas koeficientu atšķirībām gaismas vilnis, kas iet caur tiem, piedzīvo dažādas fāzes izmaiņas. Šīs fāzes izmaiņas, kas ir neredzamas tieši acij vai fotoplatei, ar speciālas optiskās ierīces palīdzību tiek pārveidotas gaismas viļņa amplitūdas izmaiņās, t.i., spilgtuma izmaiņās, kas jau ir redzamas acij vai ierakstītas gaismjutīgā ierīcē. slānis. Iegūtajā redzamajā attēlā spilgtuma (amplitūdas) sadalījums atveido fāzes reljefu. Šādā veidā iegūto attēlu sauc par fāzes kontrastu. Objekti var izskatīties tumši uz gaiša fona (pozitīvs fāzes kontrasts) vai gaiši uz tumša fona (negatīvs fāzes kontrasts). 4 Interferences kontrasta metode (traucējumu mikroskopija) Interferences kontrasta metode ir līdzīga iepriekšējai - tās abas ir balstītas uz staru traucējumiem, kas iet cauri mikrodaļiņai un iet tai garām. Paralēlu gaismas staru kūlis no apgaismotāja, nonākot mikroskopā, sadalās divās plūsmās. Viens no iegūtajiem stariem tiek virzīts caur novēroto daļiņu un iegūst izmaiņas svārstību fāzē, otrs - apejot objektu pa to pašu vai papildu mikroskopa optisko atzaru. Mikroskopa okulāra daļā abi stari atkal ir savienoti un traucē viens otru. Interferences rezultātā tiks uzbūvēts attēls, kurā šūnas apgabali ar dažādu biezumu vai dažādu blīvumu atšķirsies savā starpā kontrasta pakāpē. Interferences kontrasta metodi bieži izmanto kopā ar citām mikroskopijas metodēm, jo īpaši ar novērošanu polarizētā gaismā. Tā lietošana kopā ar ultravioleto mikroskopiju ļauj, piemēram, noteikt nukleīnskābju saturu objekta kopējā sausā masā. 5 Polarizācijas mikroskopija Polarizācijas mikroskopija ir izotropisku objektu novērošanas metode, t.i., polarizētā gaismā. Submikroskopisko daļiņu sakārtota orientācija. Polarizējošā mikroskopa kondensatora priekšā ir novietots polarizators, kas pārraida gaismas viļņus ar noteiktu polarizācijas plakni. Pēc parauga un objektīva tiek novietots analizators, kas var pārraidīt gaismu ar tādu pašu polarizācijas plakni. Ja pēc tam analizatoru pagriež par 90° attiecībā pret pirmo, gaisma caur to neizies. Gadījumā, ja starp šādām krustotām prizmām atrodas objekts, kuram ir spēja polarizēt gaismu, tas būs redzams kā spīdošs tumšā laukā. Izmantojot polarizējošo mikroskopu, var pārbaudīt, piemēram, micellu orientētu izvietojumu augu šūnu sieniņās. 6 Svarīgs šūnu pētījums Gaismas mikroskopijas metodes dod mums iespēju novērot dzīvās šūnas. Īslaicīgai novērošanai šūnas parasti ievieto šķidrā vidē uz stikla priekšmetstikliņa. Bet ilgākam laikam ir vajadzīgas citas metodes. Bieži vien ilgstošai novērošanai tiek izmantotas īpašas kameras (plakanas pudeles ar caurumiem, kas pārklātas ar plānu stiklu, vai saliekamas plakanas kameras). Šūnas tiek pētītas tām īpaši izvēlētās barotnēs. Parasti vienšūņiem tie ir sabalansēti sāls šķīdumi, kam pievienoti mikroorganismi un citi vienšūņi, kas kalpo par barību pētījuma objektam. Daudzšūnu organismu brīvās šūnas var pētīt asins plazmā vai īpašās sintētiskās barotnēs. Lai pētītu dzīvnieku šūnas un audus, tiek izmantota šūnu kultūras metode. Šūnu kultūra ir process, kurā in vitro atsevišķas šūnas (vai viena šūna) tiek mākslīgi audzētas kontrolētos apstākļos turpmākai izpētei. Šīs metodes vienkāršāka versija ir tāda, ka nelielu dzīvo audu gabalu ievieto kamerā ar barības vielu šķīdumu un pēc kāda laika perifērijā sākas šūnu augšana un dalīšanās. Otrs veids, kā iegūt šūnu kultūru, ir apstrādāt audu gabalu ar tripsīnu vai helatonu (kas novedīs pie šūnu disociācijas) un pēc tam ievietot to traukā ar barības vielu ekstraktu, kur pēc tam, kad šūnas nogrimst apakšā un piesaistīt, kultūra sāk augt un vairoties. Šūnu kultūrai ir vēlams izmantot embrionālo materiālu, kam ir lielāka spēja dalīties nekā pieaugušam materiālam. Kultivējot šūnas, jāievēro īpaši sterilitātes, temperatūras un pH nosacījumi. To pašu metodi var izmantot augu izcelsmes šūnu kultivēšanai. Lai to izdarītu, tos apstrādā ar fermentiem, kas izšķīdina šūnu membrānas, un atdalīto saturu ievieto īpašā barotnē, kur tie aug un sadalās. Kopā ar šūnu kultivēšanu parasti izmanto mikrokino un mikrofotogrāfiju, ar kuras palīdzību tiek fiksēti daudzi šūnu procesi. 6.2 Mikroķirurģijas metode Dzīvu šūnu pētīšanai tiek izmantota mikroķirurģijas metode. Šī ir ķirurģiskas iejaukšanās metode un ietekme uz šūnu, t.sk. atsevišķu organellu izņemšana vai implantācija. Šī metode ietver arī organellu transplantāciju no šūnas uz šūnu un lielu makromolekulu ievadīšanu šūnā. Parasti mikromanipulatoru kombinē ar mikroskopu, ko izmanto, lai uzraudzītu ķirurģiskās iejaukšanās gaitu. Mikroķirurģijas instrumenti ir stikla āķi, adatas, kapilāri, kas izgatavoti “mikrokalumos”. Mikrooperāciju laikā šūna tiek ievietota speciālā kamerā, kurā tiek ievietoti arī instrumenti. Pēdējā laikā plaši izmanto arī lāzera mikrostarus un UV mikrostarus. Tos izmanto, lai mērķētu uz šūnām pētījumu laikā. 6.3. Fluorescences mikroskopijas metode Palielināta attēla iegūšanas metode, izmantojot parauga ierosināto atomu un molekulu mirdzumu. Fluorescences mikroskopā paraugs tiek apstarots ar gaismu ar lielāku frekvenci, un attēls tiek iegūts optiskajā spektrā. Fluorescējošās zāles attēlu var fotografēt ar specializētu digitālo kameru, kas ļauj uzņemt ilgstošas ekspozīcijas attēlus. Diezgan bieži tiek izmantotas vielas, kas spēj fluorescenci, vai šūnā tiek ievadīti fluorescējoši līdzekļi. Viens no fluorescences mikroskopijas veidiem ir konfokālā mikroskopija, kas ļauj uzņemt attēlus no kāda dziļuma parauga vidū. 1.6.4. Konfokālās skenējošās gaismas mikroskopijas metode Lai iegūtu objekta trīsdimensiju rekonstrukciju, tiek izmantots konfokālās gaismas skenēšanas mikroskops. To izmanto, lai iegūtu virkni secīgu šūnu sekciju, kas ņemtas no dažādiem dziļumiem. Pēc šī īpašā datorprogramma apvieno šos attēlus, un mēs varam iegūt objekta trīsdimensiju, trīsdimensiju attēlu. 7 Fiksēto šūnu izpēte Daudz datu par šūnu struktūru un darbību tika iegūts, izmantojot fiksētās šūnas. Fiksācija ir sarežģīts process, kura mērķis ir iznīcināt šūnu, apturēt šūnu enzīmu darbību, komponentu sadalīšanos, izvairīties no struktūru un vielu zuduma, kā arī to iegūšanas, ja dzīvā šūnā to nebija. Bet diemžēl vēl nav fiksatora, kas atbilstu visām šīm prasībām. 7.1. Citoķīmiskās analīzes metodes Šī ir krāsošanas metožu sērija, kuras galvenais mērķis ir identificēt konkrētas ķīmiskās vielas šūnā. Ir vairākas krāsošanas metodes, kas tieši atklāj noteiktas vielas. Šādām citoķīmiskajām reakcijām ir prasības: krāsvielu saistīšanās specifika, vielas lokalizācijas nemainīgums. Šādas reakcijas piemērs ir Feulgen reakcija uz DNS. 7.2. Citofotometriskā metode Šī metode ļauj kvantitatīvi izmērīt citoķīmiskās reakcijas galaproduktu. Tas ir balstīts uz vielu skaita noteikšanu pēc noteikta viļņa garuma gaismas absorbcijas. Staru absorbcijas intensitāte ir proporcionāla vielas koncentrācijai vienā un tajā pašā objekta biezumā. Šai metodei tiek izmantoti mikroskopi-citofotometri (aiz to lēcām atrodas jutīgs fotometrs). Šo metodi plaši izmanto DNS daudzuma noteikšanai pēc Feulgen reakcijas. Tāpat iespējams kvantitatīvi noteikt ne tikai gaismu absorbējošās, bet arī gaismu izstarojošās vielas. Uz to balstās fluorometrija. 7.3 Imūnķīmiskās izpētes metode (imūnķīmiskā reakcijas, izmantojot fluorescējošas antivielas) Metodei ir augsta jutība un specifiskums. Ir tiešās un netiešās imunofluorescences metodes, pirmajā gadījumā antigēns saistās ar antivielu, kas konjugēta ar fluorescējošu marķējumu (fluorohroms, piemēram, FITC vai TRITC, otrajā gadījumā antigēns saistās ar nekonjugētu specifisku antivielu (primāro antivielu). Fluorescējošais marķējums ir konjugēts ar sekundāro antivielu, kas ir specifiska primārās antivielas Fc fragmentam Lai iezīmētās antivielas iekļūtu šūnā, ir nepieciešams padarīt membrānu caurlaidīgāku. Tas parasti tiek panākts, fiksējot šūnas un daļēji ekstrahējot no membrānām. 7.4. Autoradiogrāfijas metode Šo metodi izmanto, lai noteiktu biopolimēru sintēzes vietu lokalizāciju, noteiktu vielu pārneses ceļus šūnā un uzraudzītu migrāciju vai šūnu īpašības. Šim nolūkam tiek izmantota ar izotopiem marķēto vielu reģistrācija. Metode atkārto Bekerela metodi. Kopā ar šūnām vidē tiek ievadīts vienas no vielām prekursors, kurā viens no atomiem ir aizstāts ar radioaktīvo izotopu. Sintēzes procesā iezīmētais atoms iekļūs pašā molekulā un to var ierakstīt, izmantojot fotoemulsiju. Šīs metodes precizitāte ir atkarīga no AgBr graudu izmēra un daļiņu enerģijas. Tāpēc autoradiogrāfijas metodei tiek izmantota īpaša smalkgraudaina fotogrāfiskā emulsija un zemas enerģijas izotopi. Ūdenī šķīstošos savienojumus nevar pētīt ar autoradiogrāfiju, jo var tikt zaudēti atomi. 7.5. Molekulārās hibridizācijas metode Iepriekšējās metodes izmantošana kopā ar autoradiogrāfijas metodi dod mums iespēju lokalizēties hromosomu vietās ar noteiktu nukleotīdu secību vai pat noteiktu gēnu atrašanās vietu. Lai to izdarītu, preparātam ar denaturētu DNS kā daļu no hromosomām vai kodoliem uzklāj šķīdumu ar iezīmētu nukleīnskābi. DNS renaturācijas procesā veidojas iezīmētās nukleīnskābes un sākotnējās DNS komplementāra reģiona hibrīds. Šāda savienojuma atrašanās vieta tiek reģistrēta autoradiogrāfiski. Šo metodi izmanto arī nukleīnskābju krāsošanai ar fluorohromiem. Tas nozīmē, ka mēs varam noteikt jebkuras DNS sekvences pozīciju. Tā kā jautājums par izšķirtspējas palielināšanu vienmēr ir bijis aktuāls, zinātnieki ir nonākuši pie secinājuma, ka gaismas mikroskopijā ir iespējams palielināt izšķirtspēju, tikai izmantojot gaismas avotu, kas izstaro viļņus ar mazāko viļņa garumu. Šāds avots varētu būt karsts kvēldiegs, kas izstaro elektronu plūsmu, kuru var fokusēt, izlaižot to caur magnētisko lauku. Pamatojoties uz to, tika izveidots gaismas mikroskops. Pašlaik tiek nošķirta transmisijas elektronu mikroskopija (TEM) un skenējošā elektronu mikroskopija (SEM). Tālāk tiks apspriestas elektronu mikroskopijas metodes. 1 Kontrastējoši korpuskulāri objekti Ir vairākas kontrastējošas metodes. Es apskatīšu divus no tiem: negatīvu kontrastu un metālisku ēnojumu. Negatīvs kontrasts tiek veikts, izmantojot FVC, amonija molibdēnskābi un uranilacetātu. Pēc šķīduma uzklāšanas uz pētāmā objekta, pēc tam uzklājiet to uz substrāta plēvēm un nosusiniet, tad pētāmais objekts tiks iegremdēts augsta blīvuma amorfā vielā. Tādējādi fotoattēlos tie parādīsies kā balti objekti uz tumša fona. Risinājumi var arī dziļi iekļūt pētāmajā objektā un atklāt slēptās struktūras. Ir arī pozitīva kontrasta metode. Šajā gadījumā tiek izmantoti smago metālu sāļi, kas palielina objekta elektronu blīvumu, tādējādi palielinot tā kontrastu. Aizēnojums ar metāliem - metālu termiskās iztvaikošanas laikā to daļiņas izkliedējas un nogulsnējas uz pētāmā objekta slāņa veidā, kura biezums mainās atkarībā no daļiņu lidojuma virziena. Vietās, kur daļiņu stars ir ekranēts, telpa būs tumšāka. 2.2 Ultramikrotomija Ultramikrotomija ir paņēmienu kopums īpaši plānu griezumu iegūšanai, izmantojot ultratomus jeb ultramikrotomus. Ultramikrotomi ir ierīces, kas automātiski sagatavo īpaši plānas audu daļas ar ieprogrammētu biezumu (5-10 nm). Tas ir nepieciešams, jo elektronu stars, kas iet cauri biezākiem objektiem, tiek absorbēts, izraisot karsēšanu un izraisot zāļu deformāciju. Viņu procedūra ir diezgan līdzīga gaismas mikroskopijas procedūrai. Šūnas vispirms tiek fiksētas, bieži izmantojot GA (glutaraldehīdu) un pēc tam OsO 4, lai gan tos var izmantot arī atsevišķi. Pēc tam elektroinstalācija tiek veikta ar pēdējo posmu - iegremdēšanu ksilolā. Pēc tam preparātu piepilda ar epoksīda sveķiem (Epon). Tagad zāles, kas ir ieliktas cietos blokos, var sagriezt, izmantojot stikla vai dimanta nažus, lai iegūtu tik maza izmēra sekcijas, ka tiek izmantota objekta siltuma padeve. Pēc tam preparātu iekrāso, parasti ar uranilacetātu un svina nitrātu, kas kontrastē pozitīvi. Šī izgatavošanas tehnika ir pavērusi milzīgas iespējas elektronu mikroskopijas pielietošanai gandrīz visās bioloģijas un medicīnas jomās. Ir iespējams veikt pētījumus, izmantojot autoradiogrāfiju, izmantojot īpaši smalki graudainas emulsijas un milzīgu ekspozīciju. Kā arī pētījumi bez fiksācijas un iekapsulēšanas eponā, izmantojot krioultramikrotomiju. Šajā gadījumā objekts uzreiz tiek sasaldēts līdz šķidrā slāpekļa temperatūrai, ūdens nonāk stiklveida stāvoklī, un procesi tiek nekavējoties kavēti. Šādā veidā iegūtās sekcijas tiek izmantotas imūnķīmiskos pētījumos utt. Membrānas komponentu struktūras izpētei tiek izmantota sasaldēšanas-šķelšanās metode. Metode ir līdzīga iepriekšējai: objektu uzreiz atdzesē līdz šķidrā slāpekļa temperatūrai un pēc tam nogriež ar atdzesētu nazi. Slāņa virsma tiek pārklāta ar metāla un oglekļa slāni, un pēc tam objekts tiek izšķīdināts un no šķeldotas virsmas tiek iegūta kopija. Šajā gadījumā ir iespējams pētīt membrānu virsmas reljefu. 3 Augstsprieguma mikroskopijas metode Šāda mikroskopa paātrināšanas spriegums ir 1-3 miljoni voltu. Šis spriegums ļauj pārbaudīt objektus ar lielāku biezumu (1-10 mikroni), un, izmantojot stereoskopisko attēlveidošanu, mēs varam iegūt informāciju par intracelulāro struktūru 3D organizāciju ar augstu izšķirtspēju. 4 Skenējošās (rastra) elektronmikroskopijas metode Izmantojot šo metodi, objekts tiek pārklāts ar plānu iztvaicēta metāla kārtu, kas atstarojas, no kuras zonde (elektronu stars) nonāk uztveršanas ierīcē, no kuras pēc tam tiek pārraidīts signāls. Šajā gadījumā, pateicoties ļoti lielajam fokusa dziļumam, tiek iegūts gandrīz trīsdimensiju pētāmā objekta virsmas attēls. Varat arī iegūt informāciju par šūnu ķīmisko sastāvu. 3. Gaismas un elektronu mikroskopi 1 Gaismas mikroskopa uzbūve un galvenie raksturlielumi Lai saprastu gaismas mikroskopa darbības principu, ir jāņem vērā tā struktūra. Galvenā bioloģijas ierīce ir optiskā sistēma, kas sastāv no statīva, apgaismojuma un optiskām daļām. Statīva komplektācijā ietilpst kurpe; skatuve ar diapozitīvu turētāju un divām skrūvēm, kas pārvieto skatuvi divos perpendikulāros virzienos; caurule, caurules turētājs; makro un mikroskrūves, kas pārvieto cauruli vertikālā virzienā. Objekta apgaismošanai tiek izmantots dabisks izkliedēts vai mākslīgais apgaismojums, ko veic, izmantojot mikroskopu, kas pastāvīgi uzstādīts apavā vai savienots caur apgaismotāja stieni. Apgaismojuma sistēmā ietilpst arī spogulis ar plakanām un ieliektām virsmām un kondensators, kas atrodas zem skatuves un sastāv no 2 lēcām, varavīksnenes diafragmas un salokāma rāmja filtriem. Optiskā daļa ietver lēcu un okulāru komplektus, kas ļauj pētīt šūnas dažādos palielinājumos. Gaismas mikroskopa darbības princips ir tāds, ka gaismas avota gaismas kūlis tiek savākts kondensatorā un virzīts uz objektu. Caur to izejot, gaismas stari iekļūst lēcas lēcu sistēmā. Tie veido primāro attēlu, kas tiek palielināts, izmantojot okulāra lēcas. Kopumā objektīvs un okulārs nodrošina apgrieztu virtuālu un palielinātu objekta attēlu. Jebkura mikroskopa galvenās īpašības ir izšķirtspēja un kontrasts. Izšķirtspēja ir minimālais attālums, kurā atrodas divi punkti, ko atsevišķi demonstrē mikroskops. ,
Kur λ - apgaismotāja gaismas viļņa garums, α - leņķis starp objektīva optisko asi un visvairāk novirzošo staru, kas ieplūst lēcā viņam, - koeficients barotnes refrakcija. Jo īsāks ir stara viļņa garums, jo smalkākas detaļas mēs varēsim novērot caur mikroskopu. Un jo lielāka ir objektīva ciparu diafragma (n , jo augstāka ir objektīva izšķirtspēja. Gaismas mikroskops var palielināt cilvēka acs izšķirtspēju aptuveni 1000 reizes. Šis ir mikroskopa "noderīgais" palielinājums. Izmantojot gaismas spektra redzamo daļu, gaismas mikroskopa maksimālā izšķirtspējas robeža ir 0,2-0,3 mikroni. Tomēr jāņem vērā, ka gaismas mikroskopija ļauj mums redzēt daļiņas, kas ir mazākas par izšķirtspējas robežu. To var izdarīt, izmantojot “Dark Field” vai “Ultramicroscopy” metodi. Rīsi. 1 Gaismas mikroskops: 1 - statīvs; 2 - objektu tabula; 3 - sprausla; 4 - okulārs; 5 - caurule; 6 - lēcu mainītājs; 7 - mikrolēcas; 8 - kondensators; 9 - kondensatora pārvietošanas mehānisms; 10 - savācējs; 11 - apgaismojuma sistēma; 12 - mikroskopa fokusēšanas mehānisms. 2 Elektronu mikroskopa uzbūve Elektronu mikroskopa galvenā daļa ir dobs vakuuma cilindrs (gaiss tiek evakuēts, lai novērstu elektronu mijiedarbību ar tā sastāvdaļām un katoda pavediena oksidēšanos). Starp katodu un anodu tiek pielikts augsts spriegums, lai vēl vairāk paātrinātu elektronus. Kondensatora lēcā (kas ir elektromagnēts, tāpat kā visas elektronu mikroskopa lēcas) elektronu stars tiek fokusēts un ietriecas pētāmajā objektā. Pārraidītie elektroni veido palielinātu primāro attēlu uz objektīva, ko palielina projekcijas lēca, un tiek projicēts uz ekrāna, kas ir pārklāts ar luminiscējošu slāni, lai mirdzētu, kad elektroni tam saskaras. Rīsi. 2. Elektronu mikroskops: 1 - elektronu lielgabals; 2 - anods; 3 - spole pistoles regulēšanai; 4 - pistoles vārsts; 5 - 1. kondensatora lēca; 6 - 2. kondensatora lēca; 7 - spole stara noliekšanai 8 - kondensators 2 diafragmas; 9 - objektīva lēca; 10 - parauga bloks; 11 - difrakcijas diafragma; 12 - difrakcijas lēca; 13 - starpposma lēca; 14 - 1. projekcijas lēca; 15 - 2. projekcijas lēca; 16 - binoklis (palielinājums 12); 17 - kolonnas vakuuma bloks; 18 - kamera 35 mm ruļļa filmai; 19 - ekrāns fokusēšanai; 20 - ierakstu kamera; 21 - galvenais ekrāns; 22 - jonu sorbcijas sūknis. Bibliogrāfija Mācību literatūra .Yu.S. Čencovs, Ievads šūnu bioloģijā, 4. izdevums interneta vietnes .#"attaisnot">. #"attaisnot">. #"attaisnot">. #"attaisnot">. #"attaisnot">. #"attaisnot">. http://immunologja.ru/267/
Gaismas mikroskopiju izmanto, lai pētītu objektus, kuru izmēri pārsniedz cilvēka neapbruņotu acs izšķirtspēju* (apmēram 0,1–0,2 mm).
Gaismas mikroskopijas sagatavošana (mikropreparācija)- Šis ir priekšmets, kas novietots uz stikla priekšmetstikliņa un no augšas aizsargāts ar segstikliņu. Izpētot mikroparaugu ar optiskiem instrumentiem, tiek iegūts objekta vai tā laukuma palielināts attēls.
Elementāra ierīce objektu palielinātu attēlu iegūšanai ir palielināmais stikls. - abpusēji izliekta lēca, kas ievietota rāmja turētājā. Izmanto bioloģijā preparēšanas lupa ar maināmām okulāra lēcām (1. att.), kas objektus palielina 10–40 reizes.
Lai iegūtu lielāku objekta palielinājumu, izmantojiet gaismas mikroskops. Biomedicīnas pētījumos visbiežāk izmanto:
tiešās gaismas mikroskopi (bioloģiskie);
apgrieztie bioloģiskie mikroskopi;
stereoskopiskie mikroskopi;
attēlu analizatori.
Gaismas mikroskopu dizains un mērķis
Bioloģiskais mikroskops paredzēts krāsotu un nekrāsotu objektu novērošanai caurlaidīgā gaismā. Tipisks gaismas mikroskops (2. att.) sastāv no trim galvenajām daļām: mehāniskā, apgaismojuma (elektriskā) un optiskā.
Mehāniskajā daļā ietilpst statīvs, skatuve, sprūdrata (makrometriskā skrūve), mikrometriskā skrūve, caurule un revolveris.
Statīvs ir mikroskopa galvenā mehāniskā vienība. Tas sastāv no caurules turētāja (kolonnas) un pamatnes. Galvenās ierīces daļas ir uzstādītas uz kolonnas:
rotējoša ierīce - rotējošs mehānisms lēcu maiņai, kas tiek uzstādīts uz "ragavām", izmantojot īpašas vadotnes;
skrūvju sistēma rupjiem (makrometriskiem) un smalkiem (mikrometriskiem) mikroskopa regulējumiem;
objektu galds (fiksēts vai kustīgs) novērojamā objekta novietošanai;
vienība kondensatora nostiprināšanai un pārvietošanai;
piestiprināšanas vieta maināmiem stiprinājumiem (fotogrāfijām, televizoram utt.) - ja to paredz ierīces dizains.
Pamatne nodrošina mikroskopa stabilitāti; uz tā ir uzstādīti arī virs galvas vai iebūvēti apgaismojuma avoti.
Apgaismojuma daļa nodrošina vienmērīgu objekta apgaismojumu. Tas ietver spoguli (vai elektrisko gaismu) un kondensatoru.
Spogulis Mikroskops ir abpusējs – ar plakanām un ieliektām atstarojošām virsmām. Dabiskā apgaismojumā tiek izmantota ieliekta virsma, bet mākslīgajā gaismā tiek izmantota plakana virsma.
Kondensators -Šī ir lēcu sistēma, kas savāc gaismas starus kūlī ar mazāku šķērsgriezumu. Gaismas stara diametru var regulēt, mainot kondensatora diafragmas lūmenu, izmantojot īpašu sviru.
Mikroskopa optiskā sistēma sastāv no okulāra un lēcas, kas savienotas ar dobu cauruli - caurule.
Okulārs ievietots caurules augšējā caurumā; paredzēts attēla projicēšanai uz novērotāja acs tīklenes. Okulāra korpusa priekšpusē vai augšpusē ir marķējumi, kas norāda tā palielinājumu un redzamā attēla lauka lielumu (mm); piemēram, "10?/18".
Mācību mikroskopā tiek izmantoti maināmi okulāri ar palielinājumu 7 ?, 10 ? Un 15 ?, bieži aprīkots ar mikrorādītāju radiālas tumšas joslas formā. Okulārs sastāv no divām lēcu grupām: acs lēcas (vistuvāk novērotāja acij) un lauka lēcas (vērsta uz lēcu).
Objektīvs ieskrūvē revolverī un atrodas caurules apakšējā galā. Tas ietver vairākus objektīvus, kuru kopējais skaits var sasniegt 14. Jo vairāk objektīvu, jo augstāka attēla kvalitāte.
Uz katra objektīva korpusa ir norādīta šāda informācija:
palielināt - 4?, 8?, … 90?, 100?;
apertūra (lauka objektīva diametrs) - 0,20; 0,65;
papildu burtu marķējums, ja objektīvs ir īpašs (fāze - F ( Ph), polarizācija — P ( Pol), luminiscējoša - L ( L) un tā tālāk.).
Iegremdēšanas lēcas ir marķētas ar krāsainu gredzenu un iegremdēšanas veida burtu apzīmējumu *: melns gredzens - MI ( 0il), balts — VI ( W), oranžs — GI ( Glyc). Iegremdējamie objektīvi ļauj iegūt maksimāli iespējamo objekta vai tā daļas palielinājumu gaismas mikroskopijā.
Lēcas ir mazas (līdz 10?); liels (līdz 50?) un superliels (apmēram 100?) palielinājums. Mācību mikroskopā visbiežāk tiek izmantotas divu veidu lēcas: mazs palielinājums (8 reizes) un liels palielinājums (40 reizes).
Mikroskopa kopējo palielinājumu nosaka, reizinot objektīva un okulāra palielinājuma vērtības. Piemēram, kopējais palielinājums mikroskopam ar 40x objektīvu un 7? būs 40 · 7 = 280?.
Ja starp objektīvu un okulāru atrodas viena vai vairākas palielināšanas sistēmas, tad kopējais mikroskopa palielinājums ir vienāds ar visu palielinājumu reizinājumu. Mūsdienu gaismas mikroskopi var palielināt objektu aptuveni 1500-2000 reižu.
Apgrieztie un stereoskopiskie mikroskopi ir parādīti attēlā. 3.
Apgrieztais mikroskops ir parastā mikroskopa "apgriezts" dizains: tā apgaismotājs atrodas virs objekta, bet lēcas atrodas zem skatuves. Šāda ierīce nodrošina instrumentam (manipulatoram, kociņam, pipetei) brīvu piekļuvi pētāmajam paraugam novērošanas laikā.
R
ir. 3. Apgriezts ( A) un stereoskopisks ( B) mikroskopi
Apgrieztajiem mikroskopiem objekta biezumam nav lielas nozīmes: ar tā palīdzību var pētīt lielus objektus vai objektus, kas atrodas laboratorijas traukos (stikla kolbās, Petri trauciņos).
Stereoskopiskais mikroskopsļauj novērot objektu ar abām acīm gar optiskajām asīm, kas viena pret otru ir noliektas 12–17° leņķī. Tas rada objekta trīsdimensiju attēla vizuālo efektu. Stereomikroskopijai arī izmeklējamā parauga biezums nav īpaši svarīgs.
Attēlu analizatori tiek izmantoti kopš divdesmitā gadsimta 80. gadu beigām un ir balstīti uz mūsdienu objektu attēlu apstrādes metožu izmantošanu ar informācijas vākšanas, sistematizēšanas un analīzes elementiem. Turklāt par pamatu var kalpot jebkurš mikroskops, kuram ir pielikums foto, video vai digitālajai kamerai un papildu attēla izvade uz video vadības monitoru. Attēls tiek pārsūtīts uz datoru, kas aprīkots ar īpašu programmu attēlu analīzei. Izmantojot datoru, var uzlabot un rediģēt ievadītā attēla kvalitāti, akcentēt detaļas, izcelt robežas, veikt uzrakstus, veidot jaunus attēlus no veco fragmentiem utt. Iegūtajā attēlā var veikt jebkādus mērījumus ar automātisku rezultātu ierakstīšanu. Atkārtojot tās pašas manipulācijas (vai veicot rutīnas mērījumus), pietiek izveidot nepieciešamo darbību algoritmu – dators patstāvīgi veiks rezultātu statistisko apstrādi.
Gaismas mikroskopi nodrošina iespēju uzstādīt papildu piederumus, kas paredzēti:
darba apstākļu uzlabošana(piemēram, narkotiku vadītājs, binokļa pielikums, pielikumi foto un video ierakstīšanai);
mērīšana un skaitīšana (objektu mikrometri, okulāra mikrometri, okulāri ar ieliktņu režģiem);
mikroskopa funkcionalitātes paplašināšana (piemēram, Uz slīpā apgaismojuma un tumšā lauka kondensatori, fāzes kontrasta ierīces, optiskie filtri, noņemams dienasgaismas apgaismotājs).
Lekcija 13. Mikroskopija kā šūnu un audu izpētes metode.
1. Gaismas mikroskopija.
2. Elektronu mikroskopija.
Mūsdienu citoloģijā ir neskaitāmas un dažādas pētniecības metodes, bez kurām nebūtu iespējams uzkrāt un pilnveidot zināšanas par šūnu uzbūvi un funkcijām. Šajā nodaļā iepazīsimies tikai ar pamata, svarīgākajām pētniecības metodēm.
Mūsdienu gaismas mikroskops ir ļoti progresīva ierīce, kas joprojām ir ārkārtīgi svarīga šūnu un to organellu izpētē. Izmantojot gaismas mikroskopu, tiek panākts palielinājums 2000-2500 reižu. Mikroskopa palielinājums ir atkarīgs no tā izšķirtspējas, t.i., mazākā attāluma starp diviem atsevišķi redzamiem punktiem.
Jo mazāka ir mikroskopā redzamā daļiņa, jo lielāka ir tās izšķirtspēja. Pēdējo savukārt nosaka objektīva apertūra (atvērums ir optiskās sistēmas faktiskā atvēršana, ko nosaka lēcu vai diafragmu izmērs) un gaismas viļņa garums.
Mikroskopa izšķirtspēju nosaka, izmantojot formulu: a = 0,6, kur a ir minimālais attālums starp diviem punktiem; -- gaismas viļņa garums; n ir vides refrakcijas indekss, kas atrodas starp preparātu un pirmo, t.i., frontālo objektīvu; a ir leņķis starp lēcas optisko asi un visspēcīgāk novirzošo staru, kas ieplūst objektīvā, jeb staru difrakcijas leņķis.
Daļas (n sin a) saucējā norādītā vērtība ir nemainīga katram objektīvam un tiek saukta par tā skaitlisko apertūru. Skaitliskā apertūra, kā arī palielinājums ir iegravēts uz objektīva cilindra. Attiecība starp skaitlisko apertūru un minimālo izšķiramo attālumu ir šāda: jo lielāka ir skaitliskā apertūra, jo mazāks šis attālums, t.i., jo augstāka ir mikroskopa izšķirtspēja.
Mikroskopa izšķirtspējas palielināšana, kas ir absolūti nepieciešama, lai izpētītu šūnas struktūras detaļas, tiek panākta divos veidos:
1) objektīva skaitliskās apertūras palielināšana;
2) samazinot gaismas viļņa garumu, kas apgaismo zāles.
Lai palielinātu skaitlisko apertūru, tiek izmantoti iegremdēšanas objektīvi. Izmantotie šķidrumi ir: ūdens (r = 1,33), glicerīns (r = 1,45), ciedra eļļa (/1 = 1,51), salīdzinot ar gaisu, n vienāds ar 1.
Tā kā iegremdēšanas šķidrumu refrakcijas indekss ir lielāks par 1, palielinās objektīva skaitliskā apertūra un tajā var iekļūt stari, kas veido lielāku leņķi ar objektīva optisko asi nekā gadījumā, ja starp objektīva priekšējo lēcu ir gaiss. objektīvs un paraugs.
Otrs veids, kā palielināt mikroskopa izšķirtspēju, ir izmantot ultravioletos starus, kuru viļņa garums ir īsāks par redzamās gaismas staru viļņa garumu.
Tomēr mikroskopa izšķirtspēju var palielināt tikai līdz noteiktai robežai, ko ierobežo gaismas viļņa garums. Vismazākajām daļiņām, kas ir skaidri redzamas mūsdienu gaismas mikroskopā, ir jābūt lielākai par 1/3 gaismas viļņa garuma Tas nozīmē, ka, izmantojot dienasgaismas redzamo daļu ar viļņa garumu no 0,004 līdz 0,0007 mm, daļiņas, kuru viļņa garums ir vismaz 0, būs. būt redzamam mikroskopā ,0002-0,0003 mm Līdz ar to ar mūsdienu mikroskopu palīdzību ir iespējams izpētīt tās šūnas struktūras detaļas, kuru izmērs ir vismaz 0,2-0,3 mikroni.
Šobrīd ir radīti daudzi dažādi gaismas mikroskopu modeļi. Tie sniedz iespēju daudzpusīgi pētīt šūnu struktūras un to funkcijas.
Bioloģiskais mikroskops. Bioloģiskais mikroskops (MBI-1, MBI-2, MBI-3, MBR u.c.) paredzēts caurlaidīgās gaismas izgaismoto preparātu pētīšanai. Tieši šāda veida mikroskopus visplašāk izmanto šūnu un citu objektu struktūras pētīšanai.
Taču ar bioloģiskā mikroskopa palīdzību iespējams detalizēti izpētīt galvenokārt fiksētos un iekrāsotos šūnu preparātus. Lielākā daļa dzīvo, nekrāsotu šūnu ir bezkrāsainas un caurspīdīgas caurlaidīgajā gaismā (tās neuzsūc gaismu), un tās nevar detalizēti izpētīt.
Fāzes kontrasta mikroskopija. Fāzes kontrasta ierīce nodrošina dzīvu šūnu preparātu kontrasta attēlu, kas ir gandrīz neredzams, novērojot tos bioloģiskajā mikroskopā).
Fāzes kontrasta metode ir balstīta uz to, ka caurspīdīga parauga atsevišķi laukumi atšķiras no apkārtējās vides pēc laušanas koeficienta. Tāpēc gaisma, kas iet caur tām, pārvietojas ar dažādu ātrumu, t.i., tā piedzīvo fāzes nobīdi, kas izpaužas kā spilgtuma izmaiņas. Gaismas viļņu fāzu izmaiņas pārvēršas dažādu amplitūdu gaismas vibrācijās, un acs uztver preparāta kontrasta attēlu, kurā apgaismojuma sadalījums atbilst plašo iespēju sadalījumam dzīvu šūnu, to organellu un ieslēgumu izpētei. neskarts stāvoklis. Šim apstāklim ir svarīga loma, jo šūnu fiksēšana un krāsošana, kā likums, bojā šūnu struktūras.
Fāzu kontrasta ierīce bioloģiskajam mikroskopam sastāv no fāzes lēcu komplekta, kas atšķiras no parastajām gredzenveida fāzes plāksnes klātbūtnē, kondensatora ar gredzenveida diafragmu komplektu un papildu mikroskopa, kas palielina gredzenveida diafragmas attēlu. un fāzes plāksne, kad tās ir apvienotas.
Interferences mikroskopija. Interferences kontrasta metode ir tuva fāzes kontrasta mikroskopijas metodei un ļauj iegūt kontrasta attēlus no neiekrāsotām caurspīdīgām dzīvām šūnām, kā arī aprēķināt šūnu sauso svaru. Šiem nolūkiem izmantotais speciālais interferences mikroskops ir veidots tā, ka paralēlu gaismas staru kūlis, kas nāk no gaismas avota, tiek sadalīts divos paralēlos zaros - augšējā un apakšējā.
Apakšējais zars iziet cauri preparātam, un mainās tā gaismas vibrācijas fāze, bet augšējais vilnis paliek nemainīgs. Par narkotiku, t.i. lēcu prizmās abi zari atkal savienojas un traucē viens otru. Interferences rezultātā zāļu zonas, kurām ir atšķirīgs biezums vai nevienlīdzīgi refrakcijas rādītāji, tiek nokrāsotas dažādās krāsās un kļūst kontrastējošas un skaidri redzamas.
Fluorescences mikroskopija. Tāpat kā fāzes kontrasts, arī fluorescences (vai luminiscences) mikroskopija ļauj pētīt dzīvu šūnu. Fluorescence ir objekta mirdzums, ko ierosina tā absorbētā gaismas enerģija. Fluorescenci var ierosināt ultravioletie, zilie un violetie stari.
Vairākām šūnās esošajām struktūrām un vielām ir sava (vai primārā) fluorescence. Piemēram, zaļajam pigmenta hlorofilam, kas atrodams augu šūnu hloroplastos, ir raksturīga spilgti sarkana fluorescence. Diezgan spilgtu spīdumu rada A un B vitamīni un daži baktēriju šūnu pigmenti; tas ļauj atpazīt atsevišķas sugas baktērijas.
Tomēr lielākajai daļai vielu, kas atrodas šūnās, nav savas fluorescences. Šādas vielas sāk mirdzēt, atklājot dažādas krāsas, tikai pēc pirmapstrādes ar luminiscējošām krāsvielām (sekundārā fluorescence). Šīs krāsvielas sauc par fluorohromiem. Tie ietver fluoresceīnu, akridīna apelsīnu, berberīna sulfātu, floksīnu utt. Fluorohromus parasti izmanto ļoti vājās koncentrācijās (piemēram, 1:10000, 1:100000), un tie nebojā dzīvu šūnu. Daudzi fluorohromi selektīvi krāso atsevišķas šūnu struktūras un vielas noteiktā gaismā. Tādējādi akridīna oranžs noteiktos apstākļos krāso dezoksiribo nukleīnskābe(DNS) zaļā krāsā un ribonukleīnskābe (RNS) oranžā krāsā. Tāpēc sekundārā fluorescence ar akridīna oranžu tagad ir viena no svarīgākajām metodēm nukleīnskābju lokalizācijas izpētei dažādu organismu šūnās.
Turklāt fluorohromu izmantošana ļauj iegūt kontrastējošus, viegli pamanāmus preparātus, kuros var viegli atrast vēlamās struktūras, atpazīt un saskaitīt baktēriju šūnas. Fluorescences mikroskopijas metode ļauj pētīt arī izmaiņas šūnās un atsevišķās intracelulārajās struktūrās dažādos funkcionālos stāvokļos, kā arī ļauj atšķirt dzīvās un mirušās šūnas.
Ja zilos un violetos gaismas starus izmanto kā fluorescences avotu, iekārta sastāv no parastā bioloģiskā mikroskopa, zemsprieguma lampas (mikroskopam) ar zilas gaismas filtru, kas pārraida starus, kas ierosina fluorescenci, un dzeltenas gaismas filtra. kas noņem liekos zilos starus. Lai izmantotu ultravioletos starus kā fluorescences avotu, ir nepieciešams īpašs fluorescējošais mikroskops ar kvarca optiku, kas pārraida ultravioletos starus.
Polarizācijas mikroskopija. Polarizācijas mikroskopijas metode balstās uz dažādu šūnu un audu komponentu spēju lauzt polarizēto gaismu. Dažām šūnu struktūrām, piemēram, vārpstas pavedieniem, miofibrilām, skropstu epitēlija cilijām utt., ir raksturīga noteikta molekulu orientācija, un tām ir divkāršās laušanas īpašība. Tās ir tā sauktās anizotropās struktūras.
Anizotropās struktūras tiek pētītas, izmantojot polarizējošo mikroskopu. Tas atšķiras no parastā bioloģiskā mikroskopa ar to, ka kondensatora priekšā ir novietots polarizators, bet aiz parauga un lēcas ir kompensators un analizators, kas ļauj detalizēti izpētīt aplūkojamā objekta divpārkāpumu. Šajā gadījumā šūnās parasti tiek novērotas gaišas vai krāsainas struktūras, kuru izskats ir atkarīgs no zāļu stāvokļa attiecībā pret polarizācijas plakni un no divkāršās lūzuma lieluma.
Polarizējošais mikroskops ļauj noteikt daļiņu orientāciju šūnās un citās struktūrās, skaidri saskatīt struktūras ar dubultlaušanu, un ar atbilstošu preparātu apstrādi var veikt novērojumus par konkrētas šūnas daļas molekulāro organizāciju.
Tumšā lauka mikroskopija. Zāļu izpēte tumsā tiek veikta, izmantojot īpašu kondensatoru. Tumšā lauka kondensators atšķiras no parastā gaišā lauka kondensatora ar to, ka tas pārraida tikai ļoti slīpus malu starus no gaismas avota. Tā kā malu stari ir ļoti slīpi, tie neietilpst objektīvā, un mikroskopa redzes lauks šķiet tumšs, bet objekts, ko apgaismo izkliedēta gaisma, šķiet gaišs.
Šūnu preparāti parasti satur dažāda optiskā blīvuma struktūras. Uz vispārēja tumša fona šīs struktūras ir skaidri redzamas to atšķirīgā mirdzuma dēļ, un tās mirdz, jo izkliedē uz tām krītošos gaismas starus (Tyndall efekts).
Tumšā laukā var novērot dažādas dzīvas šūnas.
Ultravioletā mikroskopija. Ultravioletos (UV) starus cilvēka acs neuztver, tāpēc nav iespējams tieši pētīt šūnas un to struktūras tajās. Lai pētītu šūnu preparātus UV staros, E.M. Brumbergs (1939) izstrādāja oriģinālo ultravioleto mikroskopu MUF-1, un šobrīd ir pieejami vairāki šī mikroskopa modeļi. Metode E.M. Broomberg ir balstīts uz faktu, ka daudzām vielām, kas veido šūnas, ir raksturīgi UV staru absorbcijas spektri.
Pētot dažādas vielas dzīvās vai fiksētās nekrāsotās šūnās un audos šādā mikroskopā, preparāts tiek fotografēts trīs reizes (uz vienas plāksnes) trīs dažādu UV spektra zonu staros.
Fotografēšanai UV viļņu garumi tiek izvēlēti tā, lai katrā zonā būtu jebkuras vielas absorbcijas josla, kas neuzsūc starus pārējās divās zonās. Tāpēc fotogrāfijas, kas redzamas fotogrāfijās, visās fotogrāfijās izrādās atšķirīgas.
Pēc tam iegūtie attēli tiek ievietoti īpašā ierīcē, ko sauc par hromoskopu. Viens attēls tiek skatīts zilā krāsā, otrs zaļā, bet trešais sarkanā krāsā.
Tiek iegūti trīs krāsu attēli, kas hromoskopā tiek apvienoti vienā, un šajā objekta gala attēlā šūnas dažādās vielas izrādās nokrāsotas dažādās krāsās.
Bet ultravioletais mikroskops ļauj ne tikai fotografēt, bet arī vizuāli novērot audus un šūnas, kam tam ir īpašs dienasgaismas ekrāns.
Izmantojot šo mikroskopu, ir iespējams pārbaudīt daļiņas, kuru izmēri ir nedaudz mazāki nekā parastajā bioloģiskajā mikroskopā, jo UV stariem ir daudz īsāks viļņa garums nekā parastajiem gaismas stariem.
Tāpēc UV mikroskopa izšķirtspēja ir 0,11 μm, savukārt bioloģiskā mikroskopa izšķirtspēja, izmantojot parasto apgaismojumu, ir 0,2–0,3 μm.
Izmantojot ultravioleto mikroskopu, tiek veikta nukleīnskābju un citu šūnās esošo vielu UV staru absorbcijas kvantitatīvā noteikšana, t.i., nosaka šo vielu daudzumu vienā šūnā.
Mikrofotografēšana. Tiek veikta dažādu mikroskopisku preparātu mikrofotografēšana, lai iegūtu to palielinātu attēlu - mikrofotogrāfiju. Mikrogrāfi ir ērti atsevišķu šūnu un citu objektu struktūru izpētei; mikrofotogrāfijas ir dokumenti, kas ļoti precīzi atspoguļo visas mikroskopiskā parauga struktūras detaļas.
Mikroskopisko preparātu fotografēšana tiek veikta, izmantojot īpašas mikrofoto instalācijas vai mikrofoto piestiprināšanas kameras. Pēdējie tiek plaši izmantoti un ir piemēroti mikrofotografēšanai ar bioloģisko un jebkuru citu mikroskopu. Mikrofotokamera ir kamera, kuras objektīvs ir noņemts un aizstāts ar mikroskopu.
Mikroskopa optiskā sistēma kalpo kā šīs kameras objektīvs. Ir vairāki mikrofoto pielikumu veidi. Mikrofoto pielikumi, piemēram, MFN-8, ir ļoti ērti.
Ir arī īpašs bioloģiskais mikroskops MBI-6 ar pastāvīgu kameru. MBI-6 ļauj regulāri vizuāli pārbaudīt zāles un to fotografēt caurlaidīgā un atstarotā gaismā, gaišos un tumšos redzes laukos, ar fāzes kontrastu un polarizētā gaismā.
Mikrofilmēšanai ir liela nozīme šūnu dzīvības procesu izpētē. Lai izpētītu sīkāku informāciju par svarīgākajiem šūnā notiekošajiem procesiem, piemēram, dalīšanos, fagocitozi, citoplazmas plūsmu utt., tiek izmantota laika intervāla ierīce.
Izmantojot šo ierīci, ir iespējams ražot vai nu paātrinātu filmēšanu, ko parasti izmanto strauji notiekošos procesos, vai arī palēninātu to šūnu izmaiņu filmēšanu, kurām raksturīga lēna plūsma.
Mikrocīna filmēšana ir ne tikai metode, kas ļauj detalizēti pētīt dažādas struktūras un procesus dzīvā šūnā, bet arī metode šo procesu un visu ar tiem saistīto izmaiņu dokumentēšanai.
1. vingrinājums.
Apsveriet piedāvāto evolūcijas virzienu shēmu. Pierakstiet atbildē trūkstošo terminu, ko diagrammā norāda ar jautājuma zīmi.
Paskaidrojums: aizmirstais bioloģiskā progresa virziens ir idioadaptācija. Idiomātiska adaptācija- privātas ķermeņa izmaiņas, kas neizraisa organizācijas līmeņa paaugstināšanos (lapu apmatojums, krāsas maiņa utt.).
Pareizā atbilde ir idioadaptācija.
2. uzdevums.
Izvēlieties divas pareizās atbildes no piecām un pierakstiet ciparus, zem kuriem tās norādītas.
Var atšķirt augu šūnā, izmantojot gaismas mikroskopiju.
1. Endoplazmatiskais tīklojums
2. Mikrotubulas
3. Vacuole
4. Šūnu siena
5. Ribosomas
Paskaidrojums: Izmantojot gaismas mikroskopiju, var atšķirt tikai lielas šūnas daļas, piemēram, šūnas sieniņu un vakuolu (vecās šūnās vakuola aizņem gandrīz visu intracelulāro telpu). Mazākas organellas (mikrocaurules, endoplazmatiskais tīkls un ribosomas) var redzēt tikai ar elektronu mikroskopu.
Pareizā atbilde ir 34.
3. uzdevums.
Cik DNS molekulu pēc replikācijas ir šūnas kodolā, ja diploīdajā komplektā ir 46 DNS molekulas? Atbildē ierakstiet tikai atbilstošo numuru.
Paskaidrojums: Replikācija ir DNS molekulu dubultošanās, kas nozīmē, ka 46 molekulas pēc dubultošanās pārvēršas par 92 molekulām.
Pareizā atbilde ir 92.
4. uzdevums.
Visi zemāk uzskaitītie raksturlielumi, izņemot divus, tiek izmantoti, lai aprakstītu endoplazmatiskā retikuluma struktūru un funkcijas. Norādiet divus raksturlielumus, kas "izkrīt" no vispārējā saraksta.
1. Olbaltumvielu sadalīšanās
2. Vielu pārvadāšana
3. Oksidatīvā fosforilēšana
4. Olbaltumvielu sintēze uz ribosomām
5. Citoplazmas sadalīšana nodalījumos
Paskaidrojums: Endoplazmatiskais tīkls ieskauj kodolu, tādējādi sadalot citoplazmu nodalījumos un veicot vielu intracelulāru transportu. EPS var būt gluda vai raupja. Aptuvenais ER veic olbaltumvielu sintēzi, izmantojot ribosomas, kas atrodas uz tīkla membrānām.
Pareizā atbilde ir 13.
5. uzdevums.
Izveidot atbilstību starp mitozes procesiem un fāzēm.
Procesi
A. Izveidojas kodola membrāna
B. Māsas hromosomas atšķiras
B. Vārpsta beidzot pazūd
D. Hromosomu despirācija
D. Hromosomu centrimēri atdalās
Mitozes fāzes
1. Anafāze
2. Telofāze
Paskaidrojums: anafāze ir ātrākā dalīšanās fāze, jo hromosomas novirzās uz šūnas poliem (un hromosomu centromēri atdalās). Visi pārējie procesi notiek pēc hromosomu diverģences – telofāzē.
Pareizā atbilde ir 21221.
6. uzdevums.
Cik daudz dažādu fenotipu rodas, krustojot divus heterozigotus saldo zirņu augus ar rozā ziediem (sarkanā krāsa ir nepilnīgi dominējoša pār balto). Atbildē ierakstiet tikai fenotipu skaitu.
Paskaidrojums: ar nepilnīgu dominējošo stāvokli gēnu kombinācija sarkanai (A) un baltai (a) krāsai dod rozā krāsa(A). Divu rozāta augu krustošana:
R: Aa x Aa
G: A, a x A, a
F1: mēs sadalām pēc genotipa - 1AA:2Aa:1aa
Fenotipiskais sadalījums: 1: 2: 1 (25% sarkani, 50% rozā, 25% balti ziedi).
Pareizā atbilde ir 3.
7. uzdevums.
Visi turpmāk minētie raksturlielumi, izņemot divus, raksturo modifikācijas mainīgumu. Norādiet divus raksturlielumus, kas “izkrīt” no vispārējā saraksta, un pierakstiet ciparus, zem kuriem tie ir norādīti.
1. Dažādas formas zemūdens un virsūdens bultiņas lapas
2. Brūna un zila acu krāsa vienas ģimenes locekļu vidū
3. Viena kartupeļu auga bumbuļu lieluma izmaiņas
4. Bērzu lapu garuma atšķirība ziemeļu un dienvidu pusē
5. Bērnu ar Dauna sindromu piedzimšana
Paskaidrojums: modifikācijas mainīgums- konkrēta organisma (vai organismu grupas) mainīgums atkarībā no vides apstākļiem normālā reakcijas diapazonā. Šāda mainība ietekmē organisma fenotipu, bet neietekmē genotipu, kas nozīmē, ka šādas modifikācijas netiek mantotas. Tāpēc šāda veida mainīguma piemēri nevar būt ģenētiskas iezīmes - dažādas acu krāsas un Dauna sindroms.
Pareizā atbilde ir 25.
8. uzdevums.
Izveidot korespondenci starp procesiem un rūpnīcas nodaļām.
Procesi
A. Endospermas veidošanās
B. Zaļā dzinuma veidošanās
B. Nekustīgu gametu saplūšana
D. Ziedputekšņu caurules attīstība
D. Vairošanās un izplatīšanās ar sporām
Augu nodaļas
2. Papardes
Paskaidrojums: Papardes veido zaļu izaugumu (no sporām), kā arī vairojas un izkliedējas caur sporām. Viņu vīriešu reproduktīvās šūnas ir mobilas, un apaugļošanās notiek tikai ūdenī.
Pareizā atbilde ir 12112.
9. uzdevums.
Kādas pazīmes ir raksturīgas attēlā redzamajam organismam.
1. Slēgta asinsrites sistēma
2. Ķermeņa sadalīšana galvā, krūtīs un vēderā
3. Ventrālā nerva vads
4. Četri kāju pāri
5. Viens antenu pāris
6. Elpošana ar plaušu maisiņu un traheju palīdzību
Paskaidrojums: zirnekļveidīgajiem ir četri kāju pāri, atvērta asinsrites sistēma, ķermeņa daļas: galvas torakss un vēders, ir vēdera nervu vads, tie elpo ar plaušu maisiņu un traheju palīdzību. Nav antenu.
Pareizā atbilde ir 346.
10. uzdevums.
Izveidojiet atbilstību starp organismu īpašībām un valstībām, kurām tās ir raksturīgas.
Organismu pazīmes
A. Heterotrofiskais uztura veids
B. Hitīna klātbūtne eksoskeletā
B. Izglītības auduma pieejamība
D. Dzīvības aktivitātes regulēšana tikai ar ķīmisko vielu palīdzību
D. Urīnvielas veidošanās vielmaiņas laikā
E. No polisaharīdiem izgatavotas stingras šūnu sienas klātbūtne
Karaļvalstis
1. Augi
2. Dzīvnieki
Paskaidrojums: Dzīvnieku īpašības ietver heterotrofisku uztura veidu, hitīna klātbūtni eksoskeletā un urīnvielas veidošanos olbaltumvielu metabolisma procesā.
Par augu pazīmēm tiek uzskatīta audzinošo audu klātbūtne, dzīvības aktivitātes regulēšana ar ķimikāliju palīdzību un šūnu sienas klātbūtne.
Augi ir autotrofi, jo tie patērē neorganiskās vielas un pārvērš tās organiskās vielās. Eksoskelets ir tikai dzīvniekiem (posmkājiem), dzīvniekiem ir tikai nervu, epitēlija, muskuļu un saistaudi, bet augiem ir izglītības, mehāniskie, integumentārie, bazālie un vadošie audi. Dzīvnieki iekšējos procesus regulē ar nervu un humorālās regulācijas palīdzību, bet augi tikai ar ķīmisko vielu palīdzību. Dzīvniekiem veidojas urīnviela. Šūnapvalki(no celulozes) ir augos un nav dzīvniekiem.
Pareizā atbilde ir 221121.
11. uzdevums.
Izveidojiet sistemātisko taksonu secību, sākot ar lielāko.
1. Augi
2. Krūmu ķirsis
3. Rosaceae
4. Divdīgļlapji
5. Angiosperms
6. Ķirsis
Paskaidrojums: Sakārtojam taksonus sākot ar lielāko.
Karaliste – augi
Departaments - Angiosperms
Klase - Divdīgļlapji
Ģimene - Rosaceae
Stienis - Ķirsis
Tips - krūmu ķirsis
Pareizā atbilde ir 154362.
12. uzdevums.
Izvēlieties trīs pareizās atbildes no sešām un pierakstiet ciparus, zem kuriem tās norādītas.
1. Plaušu artēriju sašaurināšanās
2. Pastiprināta elpošana
3. Ūdens iztvaikošana caur sviedru dziedzeriem
4. Asins recēšanas ātruma izmaiņas
5. Ādas kapilāru paplašināšanās
6. Pazemināt asinsspiedienu
Paskaidrojums: Zaudējot siltumu, plaušu artērijas sašaurinās (paaugstināta spiediena dēļ), caur sviedru dziedzeriem iztvaiko ūdens un paplašinās ādas kapilāri (āda kļūst sarkana).
Pareizā atbilde ir 135.
13. uzdevums.
Izveidojiet atbilstību starp auss struktūrām un sekcijām, kurās tās atrodas.
Struktūra
A. Auricle
B. Ovāls logs
V. Gliemezis
G. Stremečko
D. Eistāhija caurule
E. Āmurs
Nodaļas
1. Ārējā auss
2. Vidusauss
3. Iekšējā auss
Paskaidrojums: Apskatīsim attēlu.
Iekšējā auss ietver smailes, vidusauss ietver dzirdes kauli (āmuru stapes), bet iekšējā auss ietver ovālu logu, gliemežnīcu un eistāhiju.
Pareizā atbilde ir 133232.
14. uzdevums.
Sakārtojiet dažāda līmeņa sistēmu pakļautību pareizā secībā, sākot ar lielāko.
1. Formēti elementi
2. Sarkanās asins šūnas
3. Hemoglobīns
4. Dzelzs jons
5. Saistaudi
6. Asinis
Paskaidrojums: Sakārtojam struktūras, sākot no lielākajām: saistaudi - asinis - veidotie elementi - eritrocīts - hemoglobīns - dzelzs jons. Dzelzs ir daļa no hemoglobīna proteīna, kas pārnēsā skābekli un atrodas uz sarkano asins šūnu - izveidotā asins elementa. Asinis ir viens no saistaudu veidiem.
Pareizā atbilde ir 561234.
15. uzdevums.
Izlasi tekstu. Izvēlieties trīs teikumus, kas raksturo augu sugas Pemphigus vulgare ekoloģisko kritēriju. Pierakstiet ciparus, zem kuriem tie ir norādīti.
1. Pemphigus vulgaris galvenokārt sastopams Vidusjūras reģionā Eiropā un Āfrikā. 2. Parastā pūslīša aug grāvjos, dīķos, stāvošās un lēni plūstošās ūdenskrātuvēs un purvos. 3. Augu lapas tiek sadalītas daudzās pavedieniem līdzīgās daivās, un lapas ir aprīkotas ar pūslīšiem. 4. Pemfigus zied no jūnija līdz septembrim. 5. Ziedi nokrāsoti dzeltenā krāsā, 5-10 uz kātiņa. 6. Parastā pūslīša ir kukaiņēdājs augs.
Paskaidrojums: Ekoloģiskais kritērijs raksturo sugas dzīvesveidu un attiecības ar citiem organismiem. 2. teikums - raksturo biotopa iezīmes (nevis konkrētas vietas, bet vispārīgi).
4. teikums - ziedēšanas laiks (kas nozīmē apputeksnēšanu).
6. ieteikums – uztura īpatnības.
Pareizā atbilde ir 246.
16. uzdevums.
Saskaņojiet piemērus ar evolūcijas pierādījumiem.
Piemēri
A. Fosilās pārejas formas
B. Homologi orgāni
V. Rudiments
G. Fosilijas
D. Atavisms
E. Vienots ķermeņa plāns
Evolūcijas liecības
1. Paleontoloģiskais
2. Salīdzinošā anatomiskā
Paskaidrojums: Paleontoloģiskie pierādījumi ietver to, ko atklāj zinātnieki - fosilās pārejas formas, fosilijas. Viss pārējais ir salīdzinoši anatomiski pierādījumi - homologi orgāni, rudimenti, atavismi, vienots strukturālais plāns.
Atavisms- tāliem senčiem raksturīgu pazīmju parādīšanās ķermenī (mati, vairāki sprauslas utt.).
Rudiments- orgāni, kas zaudējuši savu funkciju (gudrības zobi, apendikss, astes kauls, trešais plakstiņš utt.).
Pareizā atbilde ir 122122.
17. uzdevums.
Izvēlieties trīs pareizās atbildes no sešām un pierakstiet ciparus, zem kuriem tās norādītas.
Patērētāji ekosistēmā ietver
2. Puves baktērijas
3. Zaļie augi
4. Artiodaktili
5. Plēsēji
6. Cianobaktērijas
Pareizā atbilde ir 145.
18. uzdevums.
Izveidojiet atbilstību starp pazīmēm un ekosistēmām.
Zīmes
A. Plaši elektrotīkli
B. Īss pārtikas ķēdes
B. Zema pašregulācija
D. Ražotāju dažādība
D. Dzīvnieku sugu daudzveidība
E. Monokultūru dominēšana
Ekosistēmas
1. Spalvu zāles stepe
2. Kviešu lauks
Paskaidrojums: Būtībā uzdevums prasa nošķirt dabisko ekosistēmu (spalvu zāles stepi) no agroekosistēmas (kviešu lauka).
Agroekosistēmu raksturo īsas barības ķēdes, zema pašregulācija un monokultūru dominēšana. Viss pārējais ir stabilas dabiskās ekosistēmas pazīmes.
Pareizā atbilde ir 122112.
19. uzdevums.
Nosakiet ekosistēmu parādīšanās un attīstības secību uz kailiem akmeņiem.
1. Zvīņu ķērpji un baktērijas
2. Zālāju un krūmu kopiena
3. Meža kopiena
4. Zālaugi ziedoši augi
5. Sūnas un frutikozes ķērpji
Paskaidrojums: uz kailajiem akmeņiem augu kopiena veidojas tāpat kā augu dzīvības attīstība uz Zemes. Tas ir, garozas ķērpji un baktērijas, tad sūnas un frutikozes ķērpji, tad zālaugu ziedaugi, zālaugu-krūmu kopiena un, visbeidzot, meža kopiena.
Pareizā atbilde ir 15423.
20. uzdevums.
Apskatiet attēlu, kurā attēlota sirds cikla fāze. Nosakiet šīs fāzes nosaukumu, tā ilgumu un asins kustības virzienu. Aizpildiet tukšās tabulas šūnas, izmantojot sarakstā norādītos procesa terminus.
Terminu un procesu saraksts:
1. Ventrikulāra sistole
2. Priekškambaru sistole
3. Asins plūsma no sirds kambariem uz artērijām
4. 0,1 s
5. 0,8 s
6. Asins plūsma no ātrija uz sirds kambari
7. Asins plūsma no vēnām ātrijā
8. 0,3 s
Paskaidrojums: Attēlā parādīta priekškambaru kontrakcijas fāze (priekškambaru sistole). Šajā gadījumā asinis no atriuma nonāk kambarī. Process notiek ļoti ātri un aizņem 0,1 s.
Pareizā atbilde ir 246.
21. uzdevums.
Analizējiet tabulu “Laiks, kas nepieciešams testa attēla atpazīšanai”. Tēmām tika parādīti cipari dažādas krāsas un dažādas sarežģītības melnbalti attēli. Tika reģistrēts laiks, kas nepieciešams, lai subjekts atpazītu un nosauktu objektu.
Attēli |
Vidējais atpazīšanas laiks (ms) |
Vienkārši |
25,0 |
Vidēja grūtības pakāpe |
37,5 |
Komplekss |
70,0 |
Melni cipari |
27,5 |
Sarkanie cipari |
37,5 |
Zilie cipari |
62,5 |
Zaļie cipari |
45,0 |
Dzelteni cipari |
67,5 |
Izvēlieties apgalvojumus, kurus var formulēt, pamatojoties uz iesniegto datu analīzi.
1. Laiks, kas nepieciešams ciparu atpazīšanai, nav atkarīgs no to krāsas
2. Melni objekti tiek atpazīti ātrāk nekā krāsaini objekti
3. Jo vienkāršāks objekts, jo mazāk gaismas ir nepieciešams, lai to atpazītu
4. Krāsu numuri tiek atpazīti ātrāk nekā sarežģīti attēli
5. Krēslas laikā krāsu objektu atpazīšana kļūst vājāka
Paskaidrojums: Balstoties uz tabulā sniegtajiem datiem, melni objekti tiek atpazīti ātrāk nekā krāsaini (27,5 ms un 37,5 - 67,5 ms). Un krāsu skaitļi (maks. — 67,5 ms) tiek atpazīti ātrāk nekā sarežģīts attēls (70,0 ms). Pārējie apgalvojumi ir vai nu nepatiesi, vai tajos ir dati, kas nav tabulā.
Pareizā atbilde ir 24.
22. uzdevums.
Ir labi zināms, ka cilvēka asinīs ir olbaltumvielas un glikoze. Kāpēc vienreizēja glikozes ievadīšana asinīs nav bīstama organismam, bet lielākās daļas olbaltumvielu ievadīšana ir bīstama?
Paskaidrojums: Ar vienu glikozes injekciju asinīs ogļhidrātu metabolisma hormoni to noārda. Glikoze ir pazīstama cilvēka asins molekula (un galvenā enerģijas molekula), un olbaltumvielas (neregulējošās) normālā stāvoklī nedrīkst atrasties asinīs (jo tie ir olbaltumvielu monomēri - aminoskābes). no kuņģa-zarnu trakta. Olbaltumvielām ir antigēns raksturs, un cilvēka ķermenis tos uztvers kā svešu molekulu.
23. uzdevums.
Nosauciet attēlā redzamo objektu. Norādiet attēlā redzamo konstrukciju nosaukumus un funkcijas.
Paskaidrojums: Attēlā redzams bakteriofāgs (baktēriju vīruss). Var atšķirt galvu (olbaltumvielu kapsīds - veic aizsargfunkciju, jo satur nukleīnskābi - DNS vai RNS); astes process ar bazālo plāksni - caur šo procesu vīruss injicē nukleīnskābi skartajā šūnā; fibrillas - ar to palīdzību vīruss iesakņojas uz šūnas sieniņas.
24. uzdevums.
Dotajā tekstā atrodiet trīs kļūdas. Norādiet to teikumu numurus, kuros pieļautas kļūdas, un izlabojiet tās.
(1) Zivis - iedzīvotāji ūdens vide. (2) Pamatojoties uz to izcelsmi un struktūras īpatnībām, zivis iedala 2 klasēs: skrimšļainās zivis un kaulainās zivis. (3) Galva, kas vērsta uz priekšu, ir savienota ar ķermeni, kas sākas no žaunu vāku brīvās malas un beidzas ar astes reģionu. (4) Visām zivīm ir žaunas, kas no ķermeņa ārpuses atveras žaunu spraugās. (5) Visām zivīm ir peldpūslis. (b) Senākās no kaulainajām zivīm ir daivu zivis. (7) Tiem ir raksturīgas gaļīgas, zvīņainas spuras, attīstīts notohords pieaugušām zivīm, vāji attīstīts peldpūslis un citas pazīmes.
Paskaidrojums: 3. teikums - ķermenis beidzas nevis ar asti, bet ar tūpļa atveri.
4. teikums – ne visām zivīm ir žaunas, kas atveras no ķermeņa ārpuses ar žaunu spraugām. Daudzām zivīm ir žaunas, kuras noslēdz operkulas (kaulainas zivis).
5. teikums - peldpūšļi ir īpašs orgāns, lai pielāgotos peldēšanai, taču ne visām zivīm ir peldpūslis (lašveidīgajiem).